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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
NOTA: Um fluxo esquemático do método é descrito na Figura 1.
1. Preparação do material
NOTA: Prepare todos os reagentes assepticamente em uma capa estéril, alíquota e armazene na temperatura indicada. Os reagentes podem ser armazenados por até 2 anos sem perder seu efeito.
- Preparar CFA contendo 20 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis conforme descrito abaixo.
- Adicione 100 mg de M. tuberculosis H37RA liofilizado (ver Tabela de Materiais) e cinco esferas de aço de 3,2 mm a um tubo de 7 mL (ver Tabela de Materiais). Agite o tubo em um homogeneizador (consulte a Tabela de Materiais) por 60 s na configuração de velocidade mais alta (5.000 rpm).
- Adicione 5 mL de adjuvante de Freund incompleto (IFA) ao tubo e agite novamente por 60 s na velocidade mais alta. Transferir a pasta de M. tuberculosis homogeneizada em IFA (agora denominada CFA) para um tubo novo com uma pipeta, deixando as esferas para trás, e conservar a 4 °C até à utilização.
- Adicione água ultrapura ao pó liofilizado do peptídeo MOG35-55 (consulte a Tabela de Materiais) para obter uma concentração final de peptídeo de 10 mg / mL. Esterilizar a solução passando-a através de um filtro de 0,2 μm. Preparar alíquotas de 60 μL e armazenar a -20 °C até o uso.
nota: O peptídeo MOG35-55 usado para este experimento é de pureza ImmunoGrade (~ 70%), é clivado por TFA, dissolve-se facilmente em água e contém uma amida C-terminal (-NH2) para aumentar a estabilidade in vivo. As alíquotas peptídicas nunca foram descongeladas e recongeladas mais de duas vezes e foram armazenadas a -20 °C até o uso.
2. Preparação de emulsões CFA/peptídicas
- Calcule a quantidade de emulsão necessária para a imunização. Neste protocolo padrão, cada camundongo recebe 50 μg do peptídeo MOG35-55 e 300 μg de M. tuberculosis dispersos no adjuvante de Freund (CFA). A quantidade de cada reagente (peptídeo MOG35-55, PBS, CFA e IFA) necessária para preparar as emulsões pode ser calculada usando o Arquivo Suplementar 1. Um adicional de 20% de todos os reagentes, para compensar a pequena perda de emulsão, é incluído no cálculo.
nota: O kit de emulsão comercial (ver Tabela de Materiais) usado neste estudo compreende um tubo, tampa de rosca e um êmbolo em uma bolsa esterilizada. Cada tubo do kit de emulsão contém no máximo 9,6 mL, possibilitando a preparação de 8 seringas de 1 mL suficientes para imunizar 40 camundongos (ou 80 camundongos se usar 100 μL de emulsão por animal).
- Coloque o tubo com tampa de rosca (do kit de emulsão comercial) e os reagentes a serem usados no gelo.
- Adicione os componentes da emulsão na seguinte ordem nos volumes calculados na etapa 2.1: PBS, depois o peptídeo, depois M. tuberculosis em CFA e, finalmente, IFA.
- Feche o tubo com a tampa firmemente, apertando-o e afrouxando-o várias vezes. Agite o tubo vigorosamente por 5-10 s com a mão para pré-misturar os reagentes.
- Coloque o tubo no homogeneizador de agitação e prenda-o com a haste. Defina a velocidade para a configuração mais alta e o tempo para 60 s. Assim que a corrida terminar, coloque o tubo no gelo por 3 min. Repita a execução mais uma ou duas vezes com as mesmas configurações.
- Centrifugue o tubo a 300 x g por 1 min para remover o ar preso e compactar a emulsão.
- Remova a tampa do tubo, insira o êmbolo no tubo e empurre-o lentamente para baixo até atingir o topo da emulsão. Remova o fecho de encaixe na parte inferior do tubo girando-o.
- Remova o êmbolo de uma seringa de injeção (1 mL; consulte a Tabela de Materiais). Adicione uma agulha (de preferência 25-27 G) à seringa para injeção.
- Encaixe a extremidade traseira da seringa de injeção na trava dedicada na parte inferior do tubo e trave-a com um pequeno giro.
- Transfira a emulsão do tubo para a seringa de injecção, empurrando suavemente o êmbolo. Pare quando a emulsão atingir a graduação de 0,15 mL da seringa de injeção.
- Separe a seringa de injeção do tubo e insira o êmbolo com cuidado, tomando cuidado para que nenhum ar entre na seringa. Empurre o êmbolo até que a emulsão saia da agulha.
nota: Neste ponto, parte da emulsão pode ser usada para controle de qualidade (consulte a etapa 3).
- Repita as etapas 2.8-2.11 para o restante da emulsão presente no tubo.
nota: Para minimizar o desperdício de emulsões caras de CFA/antígeno, devem ser usadas seringas de 1 mL. Outras seringas que se encaixam na trava dedicada na parte inferior do tubo podem ser usadas; no entanto, pode ser necessário preparar um volume maior de emulsão. A emulsão peptídica CFA/MOG35-55 pode ser armazenada a 4 °C por até 15 semanas sem perder sua capacidade indutora de EAE.
3. Controle de qualidade da emulsão
- Teste de queda: Adicione uma pequena gota da emulsão em um tubo cônico estéril de 50 mL cheio de 20 mL de água fria. Feche o tubo e agite-o com a mão por alguns segundos. O aparecimento de minúsculas gotículas distintas confirma a formação de uma emulsão de água em óleo.
- Examinar a emulsão por microscopia de contraste de fase.
- Para analisar o tamanho das partículas de água em óleo, adicione uma pequena gota (2-3 μL) da emulsão a uma lâmina de microscópio, unte-a com uma lamínula e, em seguida, empurre com força em movimentos circulares para achatar a emulsão.
- Examine a emulsão manchada sob um microscópio de contraste de fase (consulte a Tabela de Materiais) com ampliação de 400x e concentre-se em um campo com uma monocamada da emulsão. Certifique-se de que pequenas partículas cinzas/brancas uniformes sejam visíveis (Figura 2A).
