Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação do mouse
NOTA: O procedimento a seguir, incluindo preparação e cirurgia do animal, levará de 30 a 40 minutos. Antes da cirurgia, ligue o microscópio e aqueça a incubadora inclusa no microscópio a 37 °C.
- Realizar experimentos em camundongos TcrdEGFP de 8 a 10 semanas de idade em um fundo C57BL / 6, que foram obtidos de Bernard Malissen (INSERM, Paris, França). De acordo com o procedimento aprovado pela IACUC, anestesiar o camundongo por injeção i.p. de cetamina (120 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) com base no peso do animal. Avalie o nível de anestesia pela frequência respiratória (55–65 respirações por minuto), pinça do dedo do pé e reflexo palpebral.
- Assim que a anestesia do plano cirúrgico for alcançada, prenda as patas traseiras do mouse usando fita adesiva a uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal, que pode ser monitorada por um termômetro retal. Se houver sinais de que a anestesia está passando (por exemplo,., aumento da frequência respiratória, piscar e/ou resposta de espasmos musculares oculares ao reflexo palpebral), readministre 50 μL de cetamina/xilazina de cada vez até que o camundongo esteja totalmente sedado.
- Prepare o corante nuclear diluindo 50 μL de Hoechst 33342 (10 mg / mL) com 315 μL de solução salina a 0,9%; a concentração final é de 37,5 mg / kg com base no peso do camundongo (volume aproximado de 200 μL). Uma vez que o camundongo esteja anestesiado, injete lentamente o Hoechst usando uma seringa de tuberculina através do seio venoso retro-orbital.
NOTA: Aguarde 1–2 minutos antes de prosseguir para a próxima etapa para permitir que o mouse se acostume à mudança no volume circulante após a injeção retroorbital.
- Coloque uma pequena quantidade de lubrificante sobre os olhos para evitar que sequem.
2. Cirurgia de camundongo: laparotomia para expor a mucosa intestinal
- Faça uma incisão vertical de 2 cm através da pele e do peritônio ao longo da linha média do abdômen inferior para exteriorizar a região do intestino a ser visualizada.
- Usando uma pinça angular, puxe cuidadosamente o ceco para fora da cavidade peritoneal e identifique a área do intestino delgado a ser visualizada. Tenha cuidado para não romper os vasos sanguíneos mesentéricos durante esse processo. Para minimizar possíveis danos ou sangramento, evite agarrar ou beliscar o intestino com uma pinça.
- Localize uma região adequada do intestino delgado (2–3 cm) para imagens que contenham conteúdo fecal mínimo. Retorne cuidadosamente o ceco e o intestino delgado remanescente para a cavidade peritoneal, deixando o segmento de interesse exteriorizado.
NOTA: Evite perfurar o ceco ou interromper a vasculatura mesentérica durante esta etapa.
- Coloque dois pares de pinças de cada lado do mesentério subjacente entre os vasos sanguíneos e esfregue suavemente as pontas das pinças para criar um orifício na membrana (Figura 1). Isso permitirá que a agulha passe pelo mesentério ao fechar a cavidade peritoneal abaixo do intestino.
- Feche a incisão enquanto mantém a alça do intestino exteriorizada. Usando uma pinça angular e uma agulha curva de ponta cônica presa a uma sutura de 5 cm, penetre em um lado do peritônio, passe pelo orifício feito na etapa anterior e suba pelo outro lado do revestimento peritoneal. Coloque uma sutura na parte superior e outra perto da parte inferior da incisão.
NOTA: Evite danificar a vasculatura durante esta etapa.
- Repita esse processo para fechar a pele abaixo da alça intestinal, colocando uma sutura no meio da incisão, entre as suturas anteriores no peritônio subjacente.
NOTA: É importante externalizar apenas a área a ser fotografada; Isso reduzirá o movimento estranho durante a imagem. Certifique-se de evitar amarrar as artérias mesentéricas.
- Use um eletrocautério para fazer uma linha de perfuração ao longo da borda antimesentérica. Imediatamente após a cauterização, aplique algumas gotas de água na superfície do intestino para evitar danos adicionais aos tecidos induzidos pelo calor. Seque com um Kimwipe para remover a água residual.
- Corte uma pequena fenda horizontal na borda distal do tecido cauterizado usando uma tesoura Vannas e prossiga para cortar ao longo do comprimento da linha cauterizada em direção à extremidade proximal do segmento de tecido externalizado (aproximadamente 1,5 cm de comprimento) para expor a superfície da mucosa.
NOTA: Se necessário, use uma pinça para remover suavemente qualquer excesso de conteúdo fecal remanescente na superfície da mucosa exposta.
- Cubra o abdômen do camundongo com um Kimwipe úmido para evitar que o tecido fique desidratado. Transporte o mouse para o microscópio em um recipiente coberto.
3. Aquisição de Imagens por Microscopia Confocal de Disco Giratório
- Pipete 150 μL de AlexaFluor 633 1 μM em HBSS no fundo de lamínula de vidro de um prato de 35 mm. Posicione o mouse de forma que a superfície da mucosa aberta entre em contato direto com a lamínula.
- Incline a cabeça do microscópio para trás e coloque o mouse na lamínula no estágio de imagem em uma incubadora pré-aquecida. Como alternativa, cubra o mouse com um cobertor de aquecimento para manter a temperatura corporal.
- Inicie o software de imagem. A intensidade de excitação e o tempo de exposição para cada laser não devem exceder 10–15 mW ou 120–150 ms, respectivamente, para evitar fotobranqueamento e minimizar o intervalo entre os pontos de tempo. Ajuste a média do quadro para "2" e ative a função de ganho EM para reduzir o ruído de fundo. Selecione a calibração da objetiva de 63x para garantir a medição correta do tamanho do pixel.
NOTA: As configurações detalhadas acima destinam-se a fornecer uma referência inicial, mas variam dependendo das configurações individuais do microscópio.
- Usando o laser de 405 nm e a objetiva de ar de 20x, visualize os núcleos para localizar um campo de vilosidades que não têm movimento perceptível ou se desviam a olho nu. Evite áreas de movimento artificial devido à respiração, peristaltismo ou batimentos cardíacos.
- Usando a varredura XY, registre a coordenada XY do campo de interesse e mude para a objetiva 63X de imersão em glicerol.
- Confirme se as vilosidades no campo selecionado estão estáveis adquirindo uma imagem ao vivo no canal de 405 nm por até 1 min.
- Ao adquirir uma imagem ao vivo no canal de 405 nm, ajuste o foco para encontrar o plano ortogonal logo abaixo da ponta das vilosidades. Adquira pilhas Z começando logo abaixo do epitélio da ponta das vilosidades até que seja difícil resolver os núcleos, cerca de 15–20 μm, usando um passo de 1,5 μm.
NOTA: Ao criar imagens com três canais (405, 488, 640 nm) usando os tempos de exposição descritos acima, é possível adquirir todos os três canais sequencialmente em intervalos de aproximadamente 20 s.
- Abra o software no modo de análise, 3–5 min após o início da aquisição, para confirmar a estabilidade da imagem e a motilidade γδ IEL. Continue a adquirir imagens por 30 a 60 minutos para cada campo de vilosidades. Registre 2 a 3 campos para cada mouse. Durante a imagem, monitore o mouse a cada 5 minutos.
