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1. Produção e Caracterização de LMPs
NOTA: Para evitar contaminação, certifique-se de que todos os materiais usados neste experimento sejam estéreis ou autoclavados. Execute todas as etapas em RT em um gabinete de segurança biológica em condições estéreis, salvo indicação em contrário.
- Estimulação e coleta de MPs
- Descongelar uma alíquota de 10 milhões de células T CEM em banho-maria a 37 °C. Diluir em 10 ml de meio hematopoiético isento de soro pré-aquecido, como X-VIVO, em tubo estéril de 15 ml e centrifugar a 200 g x 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células num meio pré-aquecido de 5 ml.
- Transferir as células para um balão de cultura de tecidos T75 (para células em suspensão) com 15 ml de meio hematopoiético pré-aquecido, como o X-VIVO, e incubar durante 4 dias numa incubadora humidificada a 37 °C com 5% de CO2.
- Após 4 dias, transferir todo o meio de cultura e as células para um balão de cultura de tecidos T175 contendo 100 ml de meio fresco. Continue incubando as células por cerca de 72 horas nas mesmas condições até que tenham crescido até uma densidade de 2 milhões de células / ml.
- Dividir uniformemente as células entre quatro frascos T175, cada um contendo 150 ml de meio fresco, e continuar a cultura celular até que as células tenham crescido (cerca de 48 horas de incubação) até uma densidade de 2 milhões/ml.
- Coletar células de cada balão por centrifugação a 200 x g durante 5 minutos e ressuspender 300 x 106 células num novo balão T175 contendo 150 ml de meio fresco, para manter a densidade celular de 2 milhões/ml.
- Adicionar actinomicina D (dissolvida em DMSO a 2 mg/ml) ao meio a uma concentração final de 0,5 μg/ml e incubar durante 24 horas.
- Transferir todo o meio de cultura para tubos cónicos de 50 ml e centrifugar as células a 750 x g durante 5 min. Transferir o sobrenadante para tubos cónicos de 50 ml e centrifugar a 1.500 x g durante 15 min para remover fragmentos de células grandes.
- Transferir o sobrenadante para um frasco de 250 ml e ultracentrifugar a 12.000 x g durante 50 min. Eliminar o sobrenadante e recolher os grânulos.
- Lave os pellets enriquecidos com LMPs com 40 ml de PBS estéril em um tubo de 50 ml por centrifugação a 12.000 x g por 50 min. Repita esta etapa duas vezes.
- Colete o último sobrenadante de lavagem; ele será usado como controle do veículo. Suspenda os pellets LMP em 1 ml de PBS e transfira-os para um microtubo estéril de 1,5 ml. Alíquota e armazene LMPs isolados a -80 °C (para evitar vários ciclos de descongelamento livre).