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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Enriqueça as células T CD8+ específicas do antígeno com células apresentadoras de antígenos artificiais de nanopartículas preparadas.
- Isole as células T CD8+.
- Eutanásia dos animais por exposição ao isoflurano seguido de luxação cervical.
- Remova o baço e os gânglios linfáticos de camundongos C57BL / 6j do tipo selvagem e coloque-os em uma solução de PBS. Macerarei os órgãos e eluirão as células através de um filtro de células estéril de 70 μm com lavagens frequentes de PBS.
- Para eliminar células T não CD8+, use um kit de isolamento de células T CD8+ sem toque e siga as instruções do fabricante.
NOTA: Cada condição de antígeno requer pelo menos 3 x 106 células T CD8 +.
- Adicione as nanopartículas aAPCs para se ligar às células T CD8+.
- Após o isolamento, concentre-se a um volume de 100 μL em PBS com 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA.
- Determine o número de aAPCs a serem adicionados calculando com base na proporção de 1011 MHC-Ig ligados a aAPC e carregados com peptídeos para cada 106 células T CD8 +.
- Incubar partículas aAPC e células T CD8+ durante 1 h a 4 °C com mistura contínua num tubo de fundo redondo de poliestireno estéril de 5 ml.
- Prepare meio suplementado e fator de crescimento de células T (TCGF) para eluir e cultivar células T CD8+.
- Para meios suplementados, suplemente o meio RPMI 1640 completo (com glutamina) com 1x aminoácidos não essenciais, 1 mM de piruvato de sódio, 0,4x solução vitamínica, 92 μM de 2-mercaptoetanol, 10 μM de ciprofloxacina e 10% de soro fetal bovino (FBS).
- Para fazer TCGF, siga os protocolos estabelecidos.
nota: O TCGF é um coquetel interno de citocinas imunológicas humanas que é essencial para fornecer às células T sinais de estimulação adicionais necessários para crescer. O TCGF pode ser trocado por citocinas estimuladoras de células T conhecidas, como IL-2, IL-7 ou IL-15; no entanto, cada um pode polarizar a resposta das células T de acordo.
- Lave e enriqueça a mistura de células T aAPC e CD8+.
- Lave os aAPCs de partículas magnéticas, primeiro usando o tampão PBS com 0,5% de BSA e 2 mM de EDTA, segundo usando meio suplementado e terceiro usando meio suplementado com 1% de TCGF.
- Eluir aAPCs e células T CD8+ enriquecidas em 500 μL de meio suplementado com 1% de TCGF.
- Conte as células usando um hemocitômetro e placa em uma placa de fundo em U 96 em 160 μL por poço de meio suplementado com 1% de TCGF a uma concentração de 2,5 x 105 células T CD8 + / mL.
- Se isolar usando aAPCs com apenas MHC-Ig carregado com peptídeo na superfície (sem sinais co-estimulatórios), conclua a Etapa 4.5. Se isolar usando aAPCs com MHC-Ig carregado com peptídeos na superfície e sinais co-estimulatórios, prossiga para a Etapa 5.
- Adicione as partículas magnéticas revestidas com sinais co-estimulatórios na superfície à fração enriquecida e adicione um campo magnético para co-agrupar os sinais estimulatórios na superfície das células T.
- Às frações enriquecidas, adicione um anticorpo estimulador equimolar (ou maior, dependendo da aplicação - consulte a seção sobre propriedades aAPC para controlar) ao número de MHC-Ig carregado com peptídeos na partícula.
- Permitir que as partículas magnéticas co-estimulatórias se liguem às células T CD8+ enriquecidas durante 1 h a 4 °C.
- Adicione um campo magnético colocando a placa de cultura entre dois ímãs de disco de neodímio N52 de 1,9 cm (0,75 polegadas) de comprimento.
nota: Os ímãs de disco N52 têm um campo extremamente forte. Deve-se tomar cuidado para armazená-los com espaçadores entre os ímãs, pois é difícil removê-los um do outro ao colocá-los nas placas de cultura. Para minimizar que os ímãs grudem nos componentes metálicos da incubadora, coloque-os em recipientes de isopor de tubo cônico de 50 mL na parte inferior e superior.
2. Expandir e detectar células T CD8+ específicas do antígeno com células apresentadoras de antígenos artificiais de nanopartículas preparadas
- Adicione a placa de 96 poços com fundo em U com aAPCs e células T CD8 + em uma incubadora umidificada de CO5% 2, 37 ° C por 3 dias. No dia 3, alimente as células com 80 μL por poço de meio suplementado com 2% de TCGF e coloque-as de volta na incubadora até o dia 7.
- No dia 7, colha as células estimuladas em um tubo inferior redondo de 5 mL para contagem.
- Depois que toda a solução for colhida, gire as células colhidas para ressuspender em 0,5 mL de PBS com 0,05% de azida sódica e 2% de FBS. Conte as células viáveis colorando-se com azul de tripano e contando com um hemocitômetro.
- Remova 50.000-500.000 células contadas em dois novos tubos de fundo redondo de 5 mL para coloração específica do antígeno. Um tubo será usado para a coloração peptídica-MHC cognato e o outro tubo será usado para a coloração não cognata para determinar a coloração de fundo.
- Adicionar 1 μg de MHC-Ig biotinilado aos respetivos tubos cognatos e não cognatos em 100 μL de PBS com 0,05% de azida sódica e 2% de FBS com CD8a de rato conjugado com aloficocianina (APC), clone 53-6,7 (razão de diluição de 1:100) durante 1 h a 4 °C.
- Adicione estreptavidina secundária e corante de morto-vivo. Lave o excesso de MHC-Ig biotinilado com PBS por centrifugação. Em seguida, comine todas as amostras com uma proporção de 1:350 de estreptavidina marcada com ficoeritrina (PE) e uma proporção de 1:1000 de uma coloração de células mortas verdes vivas/mortas fixáveis por 15 min a 4 °C.
- Leia todas as amostras em um citômetro de fluxo para determinar a especificidade e o número de células específicas do antígeno.
- Lave o excesso de manchas secundárias e vivas/mortas por centrifugação e ressuspenda com 150 μL de tampão PBS com 0,05% de azida de sódio e 2% de FBS para leitura em um citômetro de fluxo.
- Determine o número e a porcentagem de células específicas do antígeno com software de análise de dados.
- Para determinar a porcentagem de células específicas do antígeno, use as seguintes portas na respectiva ordem viva+, linfócito+ (dispersão direta por dispersão lateral), CD8+ e Dímero+. Determine a porta Dimer+ comparando a coloração não cognata com a cognata.
- Determine a porcentagem de células específicas do antígeno em uma amostra subtraindo a porcentagem de Dimer+ da coloração cognata de MHC-Ig da coloração não cognata de MHC-Ig.
- Usando essa porcentagem de células específicas do antígeno, multiplique-a pelo número de células contadas, obtendo-se o número de células específicas do antígeno resultante do enriquecimento e expansão.
nota: A compensação terá que ser configurada no citômetro de fluxo, pois há sobreposição espectral com os fluoróforos usados neste painel.