Uma técnica para isolar mastócitos primários de uma cavidade peritoneal murina

Resumo

Fonte: Tsvilovskyy, V., et al. Isolamento de mastócitos derivados do peritônio e sua caracterização funcional com Ca²⁺ - J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra um método de lavagem peritoneal para isolar mastócitos maduros do tipo tecido conjuntivo da cavidade peritoneal de camundongos adultos. Ao isolar uma mistura de células imunes primárias da cavidade peritoneal, a proliferação seletiva de mastócitos é realizada em condições de cultura apropriadas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Isolamento de PMC por lavagem intraperitoneal

1. Antes do isolamento celular, prepare os materiais listados na Tabela 1.
2. Use camundongos machos de 8 a 14 semanas para isolamento de PMC. Eutanásia de um camundongo por inalação de CO₂ e confirme a morte por perda de reflexos. Pulverize o mouse com etanol 70% e fixe-o em um bloco de espuma usando pinos (lado dorsal para baixo). Remova a pele ventral do mouse usando uma tesoura de ponta romba. Evite danificar a cavidade peritoneal.
   nota: Usamos normalmente este protocolo para camundongos com um fundo genético da cepa C57BL / 6N.
3. Injetar 7 ml do meio RPMI gelado e 5 ml de ar na cavidade peritoneal utilizando uma seringa de 10 ml equipada com uma agulha de 27 G. Empurre a agulha com cuidado no peritônio e não perfure nenhum órgão. Use um ponto na região da gordura do epidídimo para reduzir o risco de perfuração do órgão.
4. Após a injeção, agite o mouse por 1 min para separar as células peritoneais no meio RPMI. Não agite o mouse com muita força, para evitar danificar os órgãos internos e contaminar a cavidade peritoneal com o sangue.
5. Reutilize a seringa de 10 mL equipando-a com uma nova cânula de 20 G. Desloque os órgãos internos para um lado inclinando o bloco de espuma e batendo-o suavemente no banco para facilitar a aspiração média do outro lado. Insira uma agulha de 20 G, incline e aspire o fluido do abdômen suave e lentamente (~ 0,5 mL / s) para evitar o entupimento dos órgãos internos. Colete o máximo de líquido possível (normalmente 5-6 mL).
6. Remova a agulha da seringa e transfira a suspensão celular coletada para um tubo de coleta no gelo. Descarte um sample tubo se houver contaminação visível do sangue.
7. Centrifugue os tubos com a suspensão da célula a ~ 300 x g por 5 min. Sob um capuz estéril, aspire o sobrenadante. Para cada ratinho, combinar os sedimentos da amostra em 4 ml de meio PMC frio (4-10 °C) e transferir a suspensão celular para um balão de cultura^{de 25 cm 2}. Adicione os fatores de crescimento IL-3 e SCF às concentrações finais de 10 ng/mL e 30 ng/mL, respectivamente. Colocar o balão contendo as células numa incubadora (37 °C e 5% de CO₂) e incubar durante ~48 h até ao procedimento seguinte.

Tabela 1: Materiais para a Etapa 1.

1	gelo
algarismo	Seringas de 10 mL
3	Agulhas de 27 g
4	Agulhas de 20 g
5	Bloco e pinos de isopor
6	Tubos de coleta (tubos de centrífuga de plástico de 50 mL)
7	70% de etanol
8	RPMI Médio (Pré resfriado e mantido no gelo)
9	Meio PMC: Meio RPMI + 20% FCS (soro fetal de bezerro) + solução de penicilina estreptomicina a 1% (Pen-Strep)
10	Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco - DPBS (sem Ca2+ e Mg2+)
11	Frascos de Cultura (25 cm)
12	Soluções estoque de fatores de crescimento (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL)
13	Pipetas sorológicas (10 mL)
14	Pontas de pipetas estéreis (20–200 μL)
15	Hemocitômetro
16	Centrífuga de bancada
17	Tesouras e pinças
18	Câmara de CO2 para camundongos
19	Capuz estéril aberto
20	Capuz estéril fechado
21	Incubadora de células (37 °C e 5% de CO2)
22	Pipetas de transferência (20–200 μL)

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI Médio	Thermo Científico	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
Fcs	Thermo Científico	R92157
IL-3	Sistemas de P&D	403-ML
Ccah	Thermo Científico	PMC2115
Penstrep	Thermo Científico	15140122
Frascos de Cultura (25 cm)	Greiner Bio-One	Nº 69160
Tubos de centrífuga de plástico de 15 mL	Sarstedt	6,25,54,502
Centrífuga de bancada	Heraeus	Megafuge 1.0R