Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Fabricação de dispositivos e litografia suave
NOTA: Técnicas padrão de litografia suave foram usadas para criar o microcanal de polidimetilsiloxano (PDMS).
- Misture o precursor PDMS em uma proporção de 10:1 de base e agente de cura.
- Despeje 30 g da mistura precursora PDMS no molde de alumínio microusinado (veja a Figura 1 para dimensões) e 20 g da mistura precursora PDMS na placa de Petri de 100 mm.
nota: A placa de Petri é usada para fazer o filme espesso de PDMS (~ 3 mm) para a camada de suporte. A camada de suporte do PDMS fornece propriedades físicas uniformes da superfície em toda a microfluídica. Alternativamente, um filme PDMS fino na lâmina de vidro pode ser usado. O molde mestre com dimensões específicas do canal foi projetado e fabricado por microfresagem na chapa de alumínio. O canal espiral usado neste estudo foi um microcanal espiral de 8 alças com uma entrada e duas saídas, com o raio aumentando de 8 mm para 24 mm para uma separação eficiente baseada no tamanho.
- Coloque o molde e a placa de Petri em um dessecador a vácuo para desgaseificar até que nenhuma bolha seja visível na superfície, normalmente 5 a 10 min. Use um aspirador doméstico para o dessecador.
- Liberar o vácuo e colocar o molde e a placa de Petri em um forno a 90 °C por 1 h.
nota: Uma placa de aquecimento ou outras ferramentas de aquecimento podem ser usadas em vez de um forno.
- Retire a forma e a placa de Petri do forno e deixe arrefecer à temperatura ambiente durante 10 min.
- Corte cuidadosamente o contorno e perfure os orifícios de acesso ao fluido no dispositivo usando um perfurador de 2 mm.
nota: O tamanho do punção pode variar dependendo do tamanho da tubulação ou guia de fluido.
- Cole uma fita adesiva no lado do canal do dispositivo e uma película espessa de PDMS e descasque cuidadosamente com uma pinça para remover a poeira.
- Trate o lado do canal do dispositivo e o PDMS simples com plasma de ar e ligue com a camada de suporte preparada do PDMS simples (Figura 1A).
- Coloque o chip na lâmina de vidro de 50 mm x 70 mm e coloque-o em um forno a 70 °C por pelo menos 30 min para aumentar a força de colagem.
2. Coleta de secreção traqueal de pacientes ventilados mecanicamente
NOTA: As secreções traqueais podem ser obtidas de pacientes ventilados mecanicamente durante os cuidados normais de rotina das vias aéreas usando um protocolo modificado dos métodos convencionais para acomodar o paciente adulto ventilado padrão. As amostras foram desidentificadas e enviadas imediatamente para processamento.
- Se a aspiração traqueal for indicada, use um cateter para extrair secreções das vias aéreas.
- Avance o cateter cuidadosamente até a metade do tubo endotraqueal e instile 5 mL de solução salina normal estéril a 0,9% de uma seringa pré-cheia de 10 mL.
- Quando o cateter estiver totalmente avançado ou a resistência for encontrada, aspire as secreções e colete-as em um recipiente de coleta de escarro estéril.
- Colete 10 mL de secreções traqueais em um recipiente estéril de escarro e coloque-o no gelo. Envie amostras imediatamente para processamento.
3. Preparação da amostra de secreção traqueal
NOTA: Todos os experimentos devem ser realizados sob um gabinete de biossegurança com o equipamento de proteção individual adequado.
- Disperse 1 mL de amostras de secreção das vias aéreas em 9 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) usando uma seringa plástica de 10 mL (para uma diluição de 10x). Use uma pipeta romba para homogeneizar a amostra de muco.
- Coe o diluente com um filtro de células de náilon de 40 μm para remover pedaços grandes ou coágulos sanguíneos, que podem bloquear o orifício de acesso microfluídico ou o canal. Coloque a amostra no gelo após o processamento.
- Disperse o diluente de cada amostra usando um volume de 100x de tampão PBS, resultando em uma suspensão diluída de 1.000x. Colocar a amostra no gelo durante toda a operação de dissociação.
4. Configuração experimental
NOTA: Todos os experimentos devem ser realizados sob um gabinete de biossegurança com o equipamento de proteção individual adequado.
- Monte o chip PDMS com a guia de fluido para aplicar fluxo uniforme a cada um dos quatro microcanais espirais (Figura 1B).
nota: Quatro canais foram usados para aumentar o rendimento por paralelização, bem como otimização do volume e densidade celular da suspensão resultante. A guia de fluido é projetada e fabricada com uma impressora 3D do tipo estereolitografia com resina transparente. A porta de entrada e saída da guia de fluido usa conectores Luer fêmeas para facilitar a conexão e a vedação estável durante a operação.
- Conecte um conector Luer macho de 1/16 de polegada à entrada, à tomada da parede interna (IW) e à porta de saída da parede externa (OW) da guia de fluido e conecte um tubo de silicone à suspensão da amostra.
- Insira pontas rombas em cada extremidade da entrada e saídas para alcançar o fundo do reservatório de amostra.
- Conecte a bomba peristáltica com a tubulação de entrada.
- Coloque a extremidade da tubulação de entrada e da tubulação de saída de IW no reservatório de amostra e coloque a extremidade da tubulação de saída OW no reservatório de resíduos (Figura 1C, D).
- Coloque o tubo de 50 mL de PBS filtrado sem cálcio e magnésio no reservatório da amostra.
- Comece a bombear a uma baixa vazão (~1 mL/min) para preparar o dispositivo.
nota: Quando as bolhas forem capturadas no canal, empurre a parte superior do canal com a pinça para desestabilizar e eliminar as bolhas de ar. Quando o dispositivo estiver totalmente cheio com solução tampão, troque o tubo PBS para preparar o tubo de amostra de secreção das vias aéreas.
- Quando a amostra for colocada no reservatório de amostras, ligue a bomba peristáltica e ajuste a vazão em 4 mL/min (Figura 1C, D).
- Quando o sample volume atingir o volume designado (~1 mL), pare a operação e desconecte o tubo de silicone.
nota: O método proposto é mais eficiente na redução de um grande volume de diluente (>50 mL) em um volume de tubo de microcentrífuga (~ 1 mL) (Figura 2).
