Marcação de linfócitos T auxiliares murinos usando anticorpos monoclonais radiomarcados

Resumo

Fonte: Hoffmann, S. H. L., et al., Marcação de linfócitos murinos por receptor de anticorpo ⁶⁴direcionado para tráfego celular in vivo por PET/CT. J. Vis. Exp. (2017)

Neste vídeo, demonstramos a radiomarcação intracelular de células T auxiliares usando anticorpos monoclonais conjugados com isótopos radioativos para imagens de tomografia por emissão de pósitrons não invasivas.

Protocolo

1. Radiomarcação de células cOVA-TH1

NOTA: Os ⁶⁴-DOTA-KJ1-26-mAb serão aplicados a células cOVA-TH1 cultivadas para permitir a marcação radioativa intracelular.

1. Para a marcação radioativa de células cOVA-TH1, extraia 37 MBq do ⁶⁴-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcado em uma seringa sem volume morto usando um calibrador de dose. Adicione 1 mL de solução salina para receber uma solução de 37 MBq/mL.
2. Suspenda as células cOVA-TH1 no meio a 2 x 10⁶ células/mL e adicione 0,5 mL da suspensão celular a cada poço em uma placa de 48 poços.
3. Adicione 20 μL da solução de 37 MBq/mL ⁶⁴-DOTA-KJ1-26-mAb recém-preparada a cada poço da placa de 48 poços. A proporção final para a marcação é de 0,7 MBq por 10⁶ células em um volume de 520 μL. Incubar a 37 °C e 7,5% de CO₂ por 30 min.
4. Após a incubação, ressuspenda cuidadosamente as células em cada poço e transfira a suspensão celular da placa de 48 poços para um tubo com tampa de rosca de 50 mL. Para minimizar a perda de células, enxágue cada poço com um meio pré-aquecido.
5. Centrifugue a suspensão de células cOVA-TH1 a 400 x g por 5 min, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mL de PBS pré-aquecido. Remova uma alíquota da suspensão de células para contagem de células. Repita a etapa de lavagem.
6. Contar as células cOVA-TH1 viáveis numa diluição adequada com coloração com azul de tripano.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Módulo de trabalho de 64	WKL	Feito sob medida	Produção de 64
Calibrador de dose	Capintec	CRC-25R
ciclotron PETtrace	Sistemas Médicos da General Electric
DOTA-NHS	Macrocíclicos	B-280
Anticorpo anti-cOVA-TCR (KJ1-26)		Isolado de cultura de células de hibridoma	Conjugação DOTA
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	Rolamento 71633	Conjugação DOTA
H+ Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901	Conjugação DOTA
Unidade de filtro Amicon Ultra-15	Merck Millipore	UFC910008	Conjugação DOTA
Água ultrapura Rotipuran	Carl Roth	HN68.3	Conjugação DOTA
Acetato de amônio	Sigma-Aldrich	32301	Conjugação DOTA
Pbs	Universidade de Tuebingen		Conjugação DOTA
Coluna Micro Bio-spin P-6	Laboratórios Bio-Rad	7326221	Conjugação DOTA
Citrato de sódio	Sigma-Aldrich	Nº 71497	Conjugação DOTA
Cyclone Plus PhosphorImager	Perkin-Elmer	L2250116	Conjugação DOTA
DMEM	Merck Millipore	102568	Ingrediente para o meio de células T
Fcs	Merck Millipore	S0115/1004B	Ingrediente para o meio de células T
Piruvato de sódio	Merck Millipore	L0473	Ingrediente para o meio de células T
MEM-aminoácidos	Merck Millipore	K0293	Ingrediente para o meio de células T
HEPES	Merck Millipore	L 1613	Ingrediente para o meio de células T
Penicilina/estreptomicina	Merck Millipore	Rolamento A2212	Ingrediente para o meio de células T
0,05 mM 2-β-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	Ingrediente para o meio de células T
Mouses DO11.10		Criação interna	Cultura de células TH1
DPBS	Gibco	14190144	Cultura de células TH1
Filtro de células 40 μm	Corning	Rolamento 352340	Cultura de células TH1
Buffer de lise ACK	Lonza	10-548E	Cultura de células TH1
CD4 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotech	130-097-145	Cultura de células TH1
Separador QuadroMACS	Miltenyi Biotech	130-090-976	Cultura de células TH1
Coluna LS	Miltenyi Biotech	130-042-401	Cultura de células TH1
Anticorpo anti-CD4 (Gk1.5)		Isolado de cultura de células de hibridoma	Cultura de células TH1
Anticorpo anti-CD8 (5367.2)		Isolado de cultura de células de hibridoma	Cultura de células TH1
Anticorpo anti-rato (MAR18.5)		Isolado de cultura de células de hibridoma	Cultura de células TH1
Complemento de coelho MA	tebu-Bio	CL3221	Cultura de células TH1
Anticorpo anti-IL-4 (11B11)		Isolado de cultura de células de hibridoma	Cultura de células TH1
cOVA 323-339-peptídeo	Micro-coleções EMC	Pedido personalizado	Cultura de células TH1
CPG1668-oligonucleotídeos	Eurofins MWG Operon	Pedido personalizado	Cultura de células TH1
IL-2	Novartis	Nº 65483-116-07	Cultura de células TH1
Placas de 96 poços	Greiner	Nº 655180	Cultura de células TH1
Placas de 24 poços	Greiner	Nº 662160	Cultura de células TH1
Balão de cultura celular	Greiner	660175	Cultura de células TH1
Placas de 48 poços	Greiner	677 180	Rotulagem de células
Gammacell 1000	Melhor Theratronics	Através de inquérito
Gulmay RT225	Gulmay	Através de inquérito
Azul de tripano	Merck Millipore	L6323	Avaliação in vitro