Uma técnica in vitro para diferenciar células T auxiliares produtoras de GM-CSF de células T virgens

Resumo

Fonte: Lu, Y., et al. Diferenciação in vitro de células T auxiliares produtoras de fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos-camundongos (GM-CSF) (T_HGM).J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra a diferenciação in vitro do fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos ou células T auxiliares produtoras de GM-CSF (T_HGM). As células T virgens isoladas são estimuladas para diferenciação em T_HGM, o que é confirmado pela detecção de alta produção intracelular de GM-CSF e uma baixa expressão de outras citocinas específicas de células T auxiliares.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Reagente e preparação de material

1. Prepare 500 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
   nota: Mantenha o tampão no gelo durante todo o procedimento para obter os melhores resultados.
2. Prepare 50 mL de meio RPMI completo contendo RPMI 1640, 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. Use meios RPMI completos contendo 50 μM de β-mercaptoetanol para a diferenciação de células T_HGM. Adicionar o β-mercaptoetanol a uma hotte.
3. Prepare 7,5 mL de uma mistura de anticorpos anti-CD3e diluindo o estoque concentrado anti-CD3e para 3 μg / mL em PBS. Cubra as placas de 48 poços adicionando 150 μL da mistura de anticorpos a cada poço e incube a placa a 37 °C por pelo menos 1 h, ou a 4 °C durante a noite.
4. Esterilize uma tesoura e uma pinça e mantenha-as em etanol a 70% entre as dissecações.

2. Preparação de esplenócitos murinos

1. Eutanasiar o camundongo (6 a 8 semanas de idade) usando uma asfixia por CO₂ aprovada institucionalmente ou luxação cervical. Pulverize o mouse com etanol 70% e monte-o em um bloco de poliestireno nas costas. Transfira o mouse para um gabinete de segurança biológica para prosseguir com as etapas a seguir.
2. Segure a pele usando uma pinça e corte a pele abaixo da caixa torácica do lado esquerdo por cerca de 4 cm, usando uma tesoura. Abra o saco peritoneal para expor o baço e use uma pinça estéril para extrair o baço.
3. Coloque um filtro de células de 70 μm em um tubo de 50 mL e umedeça-o previamente com 2 mL de tampão. Coloque os baços no filtro celular (2–3 baços para um filtro celular) e macere-os usando a extremidade de um êmbolo de seringa de 5 mL.
4. Enxágue o filtro e o tubo várias vezes com 1–2 mL de tampão de isolamento celular até que todas as células sejam lavadas no tubo. Rejeitar o filtro de células e centrifugar as células a 350 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
5. Ressuspenda o pellet celular com 5 mL de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK) frio (4 ° C) (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM Na₂EDTA; pH 7,2–7,4) e misture-os suavemente por 2 min. Adicione 10 mL de meio RPMI completo para neutralizar o tampão ACK e centrifugue imediatamente as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante após a centrifugação.

3. Isolamento de células T CD4⁺ usando microesferas magnéticas CD4 e uma coluna de separação celular

1. Ressuspenda o pellet celular em 5 mL de tampão de isolamento celular. Filtre a suspensão celular usando um filtro de pré-separação (30 μm) em um novo tubo de 15 mL para remover quaisquer detritos.
2. Pegue 10 μL da suspensão celular e faça uma diluição de 10x adicionando 90 μL do tampão. Pegue 10 μL da suspensão celular diluída e misture com 10 μL de azul de tripano para contagem de células. Conte as células em um hemocitômetro para determinar o rendimento de células viáveis.
3. Centrifugar as células a 350 x g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
4. Ressuspenda as células em 90 μL de tampão por 10⁷ células. Adicione 10 μL de microesferas magnéticas CD4 por 10⁷ células. Incubar as células durante 15 min a 4 °C. Para obter os melhores resultados, misture a suspensão celular suavemente a cada 5 minutos durante a incubação.
5. Enquanto as células estão incubando, coloque uma coluna de separação no suporte magnético. Umedeça previamente a coluna com 2 mL de tampão.
6. No final da incubação da célula/grânulo, lavar as células com 5 ml de tampão e centrifugá-las a 350 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
7. Ressuspenda as células em 1 mL de tampão, carregue a amostra na coluna de separação de células e deixe-a fluir. Use um tubo de centrífuga de 15 mL para coletar a fração de células CD4. Adicione 1 mL de tampão para lavar o reservatório antes de secar. Repita a etapa de lavagem 2x.
8. Remova a coluna de separação de células do suporte magnético e coloque-a em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Adicione 2 mL de tampão de isolamento celular à coluna de separação de células e aplique o êmbolo firmemente para forçar as células para fora da coluna.
9. Centrifugar a fração a 350 x g durante 5 min a 4 °C para obter células CD4⁺. Descarte o sobrenadante.

4. Purificação das células T CD4⁺ Naive (CD4⁺CD25-CD44^loCD62L^hi) por Classificação de Células Ativadas por Fluorescência e diferenciação T_HGM

1. Ressuspenda o pellet de células CD4⁺ obtido em 500 μL de tampão. Misture as células com uma mistura de anticorpos conjugados com fluorescência contendo CD4-PerCp (2,8 μg/mL), CD44-APC (2,4 μg/mL), ^CD25-PE (2 μg/mL) e CD62L-FITC (10 μg/mL) (Tabela 1). Incube as células no gelo por 20 a 30 min, protegendo-as da luz.
   nota: As concentrações dos anticorpos foram otimizadas anteriormente no laboratório. O número de anticorpos listados é para células de 1 a 2 camundongos.
2. Após a incubação, lavar as células com 5 ml de tampão e centrifugar as células a 350 x g durante 5 min a 4 °C.
3. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 μL de tampão. Filtre as células novamente usando uma malha de náilon.
4. Transfira a suspensão da célula para um tubo FACS para classificação de células. Pré-revestir os tubos FACS de coleta com 500 μL de tampão.
5. Obter uma população CD4⁺CD25-CD44^loCD62L^hi (de células T CD4⁺ virgens) por classificação FACS. Gate em CD4 ⁺ CD25^- primeiro e, em seguida, selecione CD44^oucélulas^{CD62L hi} desta população.
6. Colete as frações virgens de células T CD4 ⁺ em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar as células a 350 x g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
7. Ressuspenda as células T CD4⁺ virgens a uma concentração de 106 células/ml em meio RPMI completo contendo 50 μM de β-mercaptoetanol.
8. Aspire os anticorpos anti-CD3e usados para pré-revestimento na placa de 48 poços. Semear 0,25 milhão (250 μL) de células em cada poço com IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 μg/mL) e anti-IFNγ (10 μg/mL) (Tabela 1).
   nota: As concentrações de citocinas e anticorpos foram otimizadas anteriormente no laboratório para uma diferenciação de células T_HGM.
9. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ durante 3 dias. Não mude o meio durante a incubação.

5. Análise das células GM de camundongo T_Hgeradas in vitro

1. Usando um microscópio, verifique a diferenciação celular 3 d após a diferenciação. Colha as células e centrifugue-as a 350 x g por 5 min a 4 °C. Lave as células 2x com mídia RPMI completa.
   nota: As células diferenciadas são maiores em tamanho do que as células T CD4⁺ virgens.
2. Ressuspenda as células em 1 mL de meio RPMI completo. Pegue 10 μL de suspensão celular e misture bem com 10 μL de azul de tripano para determinar o número de células com um hemocitômetro. Divida as células diferenciadas em três poções para reestimulação e análise.
   nota: A coloração intracelular de citocinas requer ≥0,5 milhão de células.
3. Para coloração intracelular de citocinas, reestimule as células com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (100 ng / mL) e ionomicina (1 μg / mL) na presença de um inibidor de transporte de proteínas (1 μL / mL) por 4-6 h.
   1. Colha as células e cove-as com anticorpo anti-CD4 (conjugado com PerCP, diluição de 0,2 mg / mL, 1:100; ou conjugado com FITC, 0,5 mg / mL, diluição de 1:100) por 30 min.
   2. Fixe as células com 200 μL de tampão de fixação por 20 a 60 min. Após a fixação, lavar as células 2x com 1 mL de tampão de permeabilização.
   3. Realize coloração intracelular com anticorpos contra GM-CSF (conjugado com PE, diluição de 0,2 mg / mL, 1: 100), IL-17A (conjugado com FITC, 0,5 mg / mL, diluição de 1: 100; conjugado com APC, 0,2 mg/mL, diluição 1:100), IL-4 (conjugado com APC, 0,2 mg/mL, diluição 1:100) e IFNγ (conjugado com APC, 0,2 mg/mL, diluição 1:100; Conjugado com PE, 0,2 mg / mL, diluição 1:100) por 30 min no escuro.

Tabela 1: Utilizou citocinas e anticorpos.

nome	Concentração de estoque	Concentração de trabalho	diluição	Volume em tampão de coloração de 500 μL
CD4-PerCp	0,2 mg/ml	2,8 μg/mL	1:71	7 μL
CD44-APC	0,2 mg/ml	2,4 μg/mL	1:83	6 μL
CD25-PE	0,2 mg/ml	2 μg/ml	1:100	5 μL
CD62L-FITC	0,5 mg/mL	10 μg/mL	1:50	10 μL
GM-CSF-PE	0,2 mg/ml	2 μg/ml	1:100
IL-17A-FITC	0,5 mg/mL	5 μg/ml	1:100
IL-17A-APC	0,2 mg/ml	2 μg/ml	1:100
IFNγ-APC	0,2 mg/ml	2 μg/ml	1:100
IFNγ-PE	0,2 mg/ml	2 μg/ml	1:100
IL-4-APC	0,2 mg/ml	2 μg/ml	1:100
CD4-FITC	0,5 mg/mL	5 μg/ml	1:100
IL-7	20 μg/mL	2 ng/mL	1:10000
Anti-CD28	0,5 mg/mL	1 μg/ml	1:500
Anti-IFNγ	1 mg/ml	10 μg/mL	1:100

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640	Biooeste	L0500-500
FBS inativado por calor	Capricórnio	FBS-HI-12A
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140122
10x PBS	1ª Base	BUF-2040-10	Diluído para 1x PBS em água estéril
Edta	1ª Base	BUF-1053-100ml-pH8.0
Buffer ACK 10X	Biolenda	420301	diluído em água estéril
Filtro de células	Ciências da Vida SPL	Rolamento 93070
Microesferas CD4	Miltenyi Biotec	130-049-201
2-Mercaptoetanol	sigma	M7522
Coluna LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
Suporte magnético	Miltenyi Biotec	130-042-303
Seringa de 1ml	Terumo	SS+01T
centrifuga	Eppendorf	Eppendorf 5810R
Classificador de células Sony SY3200	Sony	Classificador de células Sony SY3200
tubo de centrífuga cônico de 50 ml	Greiner Bio-One	210261
tubo de centrífuga cônico de 15m	Greiner Bio-One	188271
Tubo FACS	Corning	352054
CD4 para camundongos PerCP-eFluor 710	eBiociência	Telefone: 46-0041-82
CD25 anti-camundongo conjugado com PE (IL-2Ra, p55)	eBiociência	12-0251-82
anti-humano/camundongo CD44 APC	eBiociência	17-0441-82
anti-mouse CD62L FITC	eBiociência	11-0621-85
Câmara de contagem aprimorada por Neubauer	Marienfeld	Nº 640010
Solução Hyclone Trypan Blue	Ciências da Vida da GE Healthcare	SV30084.01
microscópio	Nikon	Nikon Elipse TS100
Anticorpo anti-camundongo CD3e purificado	Biolenda	100314
Hamster purificado anti-rato CD28	BD Biociências	553295
Purificado Rato anti-rato IFNγ	eBiociência	16-7312-85
Anticorpo IL-4 anti-camundongo purificado	Biolenda	504102
Proteína IL-7 de camundongo recombinante	Sistema de P&D	407-ML
Pma	Merck Millipore	19-144
Ionomicina	sigma	I0634
Inibidor de transporte de proteínas GolgiPlug	BD Biociências	51-2301KZ
Conjunto de tampão de fixação e permeabilização intracelular	eBiociência	88-8824-00
anti-mouse GM-CSF PE	eBiociência	12-7331-82
FITC anti-mouse IL-17A	Biolenda	506908
APC anti-rato IFN-gama	Biolenda	Rolamento 505810