Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Dissociação cerebral e isolamento microglial magnético
NOTA: Todas as manipulações e ressuspensões celulares devem ser realizadas com uma pipeta de 1.000 μL com muito cuidado. A aplicação de uma alta ação mecânica pode ativar ou matar as células da microglia.
- Transfira 12 pedaços de cérebro (~ 1,2 g) por tubo de dissociação contendo mistura de dissociação de acordo com a Tabela 1. Para 24 filhotes, serão necessários quatro tubos C (Figura 1A-B).
- Coloque os tubos C no dissociador (com o modo de aquecimento). Inicie o programa NTDK otimizado no equipamento de acordo com as instruções do fabricante (Figura 1D).
- Centrifugar a 300 x g durante 20 s (a 4 °C) para recolher todas as células. Complete a dissociação mecânica pipetando três vezes para cima e para baixo com uma pipeta de 1.000 μL (Figura 1E).
- Transfira as células para quatro tubos de 15 mL + filtros. Enxágue os filtros com 10 mL de 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) com Ca2+ e Mg2+ (HBSS+/+) (Figura 1F).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e retirar o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet com 10 mL de HBSS+/+ (Figura 1G).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e retirar o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet com 6 mL de tampão de classificação (1x PBS + 0,5% BSA) (Figura 1H).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e retirar o sobrenadante. Adicione 200 μL de solução de microesferas de CD11b por tubo e ressuspenda cuidadosamente ( Figura 1I ).
- Incubar os tubos durante 15-20 min a 4 °C. Ressuspender cuidadosamente o pellet com 6 ml de tampão de triagem (Figura 1I-J).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e retirar o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet com 8 mL de tampão de classificação (Figura 1K).
- Siga o programa POSSEL no separador (consulte Tabela de Materiais) para preparar oito colunas. Transfira as células de 1 mL por 1 mL na coluna. Aguarde a passagem de todas as células antes de adicionar outro mL. Eluir células CD11b + em uma placa de eluição estéril com 1 mL de tampão de triagem ( Figura 1L ).
- Agrupe células CD11b + em um novo tubo de 50 mL (Figura 1M).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e retirar o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet com 10 mL de meio frio de microglia (meio de cultura sem soro de macrófagos (SFM) + 1% de penicilina-estreptomicina (P / S)) (Figura 1N).
- Conte as células CD11b +. Em P8, deve-se obter ~ 650.000 células por cérebro.
nota: No presente protocolo, as células foram contadas usando um contador de células automatizado (ver Tabela de Materiais).
- Ressuspenda as células em meio de microglia fria até uma concentração final de 650.000-700.000 células/mL e dispense em placas de cultura de células.
nota: As placas de 6 poços são para Western Blot (2 mL por poço); as placas de 12 poços são para análise de RT-qPCR (1 mL por poço) e as placas de 96 poços são para ensaio fagocítico (250 μL por poço).
Tabela 1: Preparação da mistura de dissociação.
| solução | Para um tubo C (μL) | Para quatro tubos C (μL) |
| Tampão X | 2850 | 11400 |
| Enzima P (Papaína) | 75 | 300 |
| Enzima A (DNAse) | 15 | 60 |
| Tampão Y | 30 | 120 |
| total | 2970 | 11880 |
