Isolamento magnético de microglia de cérebros de filhotes de camundongos

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Dissociação cerebral e isolamento microglial magnético

NOTA: Todas as manipulações e ressuspensões celulares devem ser realizadas com uma pipeta de 1.000 μL com muito cuidado. A aplicação de uma alta ação mecânica pode ativar ou matar as células da microglia.

1. Transfira 12 pedaços de cérebro (~ 1,2 g) por tubo de dissociação contendo mistura de dissociação de acordo com a Tabela 1. Para 24 filhotes, serão necessários quatro tubos C (Figura 1A-B).
2. Coloque os tubos C no dissociador (com o modo de aquecimento). Inicie o programa NTDK otimizado no equipamento de acordo com as instruções do fabricante (Figura 1D).
3. Centrifugar a 300 x g durante 20 s (a 4 °C) para recolher todas as células. Complete a dissociação mecânica pipetando três vezes para cima e para baixo com uma pipeta de 1.000 μL (Figura 1E).
4. Transfira as células para quatro tubos de 15 mL + filtros. Enxágue os filtros com 10 mL de 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) com Ca²⁺ e Mg²⁺ (HBSS+/+) (Figura 1F).
5. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e retirar o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet com 10 mL de HBSS+/+ (Figura 1G).
6. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e retirar o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet com 6 mL de tampão de classificação (1x PBS + 0,5% BSA) (Figura 1H).
7. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e retirar o sobrenadante. Adicione 200 μL de solução de microesferas de CD11b por tubo e ressuspenda cuidadosamente ( Figura 1I ).
8. Incubar os tubos durante 15-20 min a 4 °C. Ressuspender cuidadosamente o pellet com 6 ml de tampão de triagem (Figura 1I-J).
9. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e retirar o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet com 8 mL de tampão de classificação (Figura 1K).
10. Siga o programa POSSEL no separador (consulte Tabela de Materiais) para preparar oito colunas. Transfira as células de 1 mL por 1 mL na coluna. Aguarde a passagem de todas as células antes de adicionar outro mL. Eluir células CD11b + em uma placa de eluição estéril com 1 mL de tampão de triagem ( Figura 1L ).
11. Agrupe células CD11b + em um novo tubo de 50 mL (Figura 1M).
12. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e retirar o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet com 10 mL de meio frio de microglia (meio de cultura sem soro de macrófagos (SFM) + 1% de penicilina-estreptomicina (P / S)) (Figura 1N).
13. Conte as células CD11b +. Em P8, deve-se obter ~ 650.000 células por cérebro.
    nota: No presente protocolo, as células foram contadas usando um contador de células automatizado (ver Tabela de Materiais).
14. Ressuspenda as células em meio de microglia fria até uma concentração final de 650.000-700.000 células/mL e dispense em placas de cultura de células.
    nota: As placas de 6 poços são para Western Blot (2 mL por poço); as placas de 12 poços são para análise de RT-qPCR (1 mL por poço) e as placas de 96 poços são para ensaio fagocítico (250 μL por poço).

Tabela 1: Preparação da mistura de dissociação.

Figura 1: Representação esquemática das dissociações cerebrais e isolamento das células microgliais. (AC) Após a dissecção do cérebro de camundongo P8 e a remoção dos bulbos olfativos e do cerebelo, os cérebros foram primeiro transferidos para uma placa de Petri com HBSS+/+ e, em seguida, para tubos de dissociação contendo a mistura de dissociação. Os tubos C foram colocados no dissociador (com o modo de aquecimento) e o programa NTDK foi iniciado (D). (E) No final do programa, os tubos foram centrifugados a 300 x g por 20 s a 4 °C; a dissociação foi então completada pipetando três vezes para cima e para baixo com uma pipeta de 1.000 μL. (F) As células foram então transferidas para tubos de 15 mL + filtros de 70 μm e enxaguadas com 10 mL de HBSS+/+. (G) As amostras foram então centrifugadas a 300 x g por 10 min a 4 °C, o sobrenadante foi removido e o pellet foi ressuspenso com 10 mL de HBSS+/+. (H) Os tubos foram novamente centrifugados a 300 x g por 10 min a 4 ° C; o sobrenadante foi removido e, em seguida, o pellet foi ressuspenso em 6 mL de tampão de triagem. (I) Os tubos foram centrifugados a 300 x g por 10 min a 4 °C, o sobrenadante foi removido e a solução de microesferas CD11b (200 μL) foi adicionada. Os tubos foram incubados por 15-20 min a 4 ° C e, em seguida, ressuspensos em 6 mL de tampão de triagem (J) e centrifugados a 300 x g por 10 min a 4 ° C. (K) O sobrenadante foi removido e o pellet foi cuidadosamente ressuspenso em 8 mL de tampão de classificação. (L) Em seguida, inicie o programa POSSEL no separador para preparar colunas. As células foram transferidas 1 mL por 1 mL na coluna e as células CD11b foram eluídas em uma placa de eluição estéril com 1 mL de tampão de classificação. As células CD11b (M) foram agrupadas em um novo tubo de 50 mL e centrifugadas a 300 x g por 10 min a 4 ° C, e o sobrenadante foi removido. (N) O pellet foi cuidadosamente ressuspenso em 10 mL de meio de microglia fria na última etapa. As células foram contadas e diluídas no meio microglial até uma concentração final de 650.000-700.000 células/mL dispensadas em placas de cultura celular.