Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Injeção intracisternal de camundongos
NOTA: Todo o procedimento é realizado no gabinete de fluxo laminar para manter as condições assépticas.
- Camundongos de laboratório domésticos (Balb/c fêmea de 8 semanas de idade) sob condições específicas livres de patógenos. Forneça pellets de comida e água ad libitum.
- Instale os animais no novo ambiente por 1 semana antes de iniciar o experimento.
- Antes de iniciar o experimento, pese e avalie a temperatura corporal.
nota: Os camundongos fêmeas Balb / c endogâmicos de oito semanas de idade pesam em média cerca de 19 g. A temperatura média dos ratos de laboratório varia fisiologicamente de 36-38 °C.
- Retirar o animal do pescoço, limpar a área do abdome com etanol a 70% e injetar i.p. dextrana de ferro (dissolvido em tampão salina fosfato a 1%, 250 mg/kg) no quadrante inferior direito do abdome murino usando uma agulha 25 G 0,5 mm x 16 mm, aproximadamente 2-3 h antes da infecção.
nota: A injeção intraperitoneal foi realizada no quadrante inferior direito do abdômen murino para evitar danos aos órgãos abdominais, como bexiga urinária, ceco, etc. A administração de uma fonte exógena de ferro, na forma de ferro dextrano, aos animais antes da infecção favorece a multiplicação bacteriana no hospedeiro.
- Após 2-3 h, realizar anestesia animal com cetamina (50 mg/kg) e xilazina (3 mg/kg) e lubrificante oftálmico.
- Verifique a profundidade da anestesia, garantindo a ausência de resposta à dor ao beliscar o dedo do pé.
- Posicione o mouse em decúbito esternal e estique cuidadosamente os membros e a coluna cervical para manter a coluna vertebral em uma posição reta.
- Misture suavemente a suspensão bacteriana para manter uma suspensão consistente antes de carregar uma seringa de agulha 30 G x 8 mm.
nota: Preparar a suspensão bacteriana o mais próximo possível do momento da injeção; Enquanto isso, armazene-o em temperatura ambiente.
- Com base no título bacteriano pós-descongelamento (UFC/mL), proceder ao cálculo do total de UFC a utilizar, em relação ao número total de animais a infetar (dose bacteriana de UFC por número de animais). Proceder ao cálculo do volume exacto a retirar do frasco para injectáveis para obter o UFC total, aplicando uma proporção entre o título bacteriano pós-descongelação (UFC/ml) e a UFC total útil para a infecção de n ratinhos (UFC pós-descongelação: ml = UFC total: x). Estabelecer o volume final em relação ao número total de animais a serem infectados.
nota: Nesses experimentos, foi utilizada uma ampla gama de títulos de 104 a 109 por animal.
- Limpe a área cirúrgica com etanol 70%.
- Identifique o ponto de injeção com a ajuda de uma agulha e injete a UFC estabelecida de meningococos (cepa selvagem e cepa mutante isogênica) ou caldo GC suplementado com dextrano de ferro (5 mg / kg) como controle, em um volume total de 10 μL na cisterna magna de camundongos através de um orifício de rebarba occipital usando uma agulha de 30 G x 8 mm.
- Realize o inóculo cisternal colocando a agulha na junção craniocervical, especificamente no espaço subaracnóideo dorsal. Ventroflex a cabeça para tornar este espaço acessível.
- Resumidamente, coloque o animal em decúbito lateral, mantenha as orelhas fora do caminho e flexione o pescoço moderadamente (90 a 100 °). Certifique-se de que a linha média do pescoço e a cabeça (do nariz ao occipital) estejam em uma posição perfeitamente paralela ao tampo da mesa.
- Toque nas asas do atlas e certifique-se de que elas se sobreponham, eliminando a rotação axial. Um recuo natural geralmente pode ser tocado na linha média, onde a agulha tem maior probabilidade de entrar no orifício occipital.
- Elimine a seringa e a agulha em segurança após a injeção de Neisseria em ratinhos.
- Coloque o animal na gaiola e aguarde o despertar e a recuperação total do movimento.
- Mantenha as gaiolas com camundongos infectados sob um gabinete de fluxo laminar.
- Monitore camundongos, 24 horas após a infecção, quanto a sinais clínicos de coma de acordo com a escala de coma. Escala de coma: 1 = coma, 2 = não fica em pé após ser virado de costas, 3 = fica em pé por 30 s, 4 = fica em pé por 5 s, atividades ambulatoriais mínimas, 5 = normal.
nota: Quando em animais foi registrada dor, foi administrada analgesia com meloxicam (5 mg/kg i.p. durante o estudo).
2. Sobrevivência animal e contagens de UFC
- Sobrevivência Animal
- Preparar inóculos bacterianos em diferentes doses (variando de 104 a 109 UFC por ratinho) para infectar os animais por via i.cist.
- Inocular camundongos controle com caldo GC, suplementado com dextrano de ferro (5 mg/kg), da mesma maneira.
- Monitore os animais quanto a sintomas clínicos: pêlo despenteado, aparência curvada, hipotermia, perda de peso, letargia ou moribundo todos os dias durante todo o experimento por 168 h (7 dias) pelo menos duas vezes ao dia durante o experimento.
- Meça o peso corporal e a temperatura usando uma balança digital e um termômetro retal, respectivamente, todos os dias.
- Registre a sobrevivência de camundongos por uma semana.
nota: Registre a morte natural do animal pós-infecção, enquanto os animais que atingirem um valor de coma de 2 ou que sobreviverem mais de 168 h de observação serão sacrificados.
- Anestesiar camundongos com coma 2 ou que sobrevivam ao longo do tempo de observação com cetamina (50 mg/kg) e xilazina (3 mg/kg) e aplicar pomada oftálmica.
- Verifique se a resposta à dor está ausente por um beliscão no dedo do pé.
- Realize a eutanásia de camundongos por luxação cervical e registre-os como mortos para análise estatística.
- Prossiga para o ensaio de sobrevivência animal ou contagem de UFC nos animais infectados.