Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Fonte e caixa do mouse
- Derive camundongos LysM-eGFP em um fundo genético C57BL / 6J. Derive camundongos LysM-EGFP×MyD88-/- cruzando camundongos LysM-EGFP com camundongos MyD88-/- em um fundo C57BL/6J.
- Ratos domésticos em um viveiro. Para esses estudos, os animais foram alojados na Universidade da Califórnia, Davis, em grupos antes da cirurgia e alojados individualmente após a cirurgia. Use camundongos entre as idades de 10 a 16 semanas.
2. Preparação e quantificação bacteriana
- Remova a cepa bioluminescente de S. aureus de interesse do armazenamento a -80 ° C para descongelar no gelo. Estria em uma placa de ágar sangue bovino a 5%. Incubar a placa listrada em uma incubadora umidificada a 37 °C durante a noite (16 h).
nota: Neste protocolo, foi utilizada a linhagem ALC2906 SH1000. Esta cepa contém o plasmídeo de transporte pSK236 com os promotores da proteína 2 de ligação à penicilina fundidos ao repórter luxABCDE da Photohabdus luminescens.
- Prepare o caldo de soja tríptico (TSB) misturando 0,03 g de pó de TSB por mL de água pura e autoclave TSB para esterilizar. Quando resfriado, adicione os antibióticos necessários usando uma técnica estéril. Neste protocolo, adicione 10 μg/mL de cloranfenicol ao TSB para selecionar a expressão do plasmídeo pSK236, que contém o luxABCDE de bioluminescência.
- Escolha 3-4 colônias separadas da placa de S. aureus em TSB com 10 μg / mL de cloranfenicol para iniciar uma cultura noturna. Incubar as bactérias num agitador de incubação a 37 °C durante a noite (16 h).
- Inicie uma nova cultura bacteriana a partir da cultura noturna diluindo uma amostra 1:50 em TSB com 10 μg / mL de cloranfenicol. Cultura em agitador de incubação a 200 rpm e 37 °C.
- Duas horas após a separação do S. aureus, monitorizar a densidade óptica a 600 nm (OD600) num espectrofotómetro. Observe o OD600 vs. tempo para encontrar o crescimento da fase logarítmica intermediária. Para a cepa ALC2906 SH1000, um OD600 de 0,5 é logarítmico médio e corresponde a uma concentração de 1 x 108 UFC/mL (Figura 1).
- Quando o OD600 for 0,5, lave as bactérias 1:1 com DPBS gelado. Centrifugue as bactérias por 10 min a 3.000 x g e 4 ° C. Decantar cuidadosamente o sobrenadante e adicionar DPBS e vórtice resfriados adicionais completamente. Centrifugue mais uma vez por 10 min a 3.000 x g e 4 °C.
- Decantar cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet bacteriano na concentração desejada. Para esses estudos, colete 3 mL de ALC2906 SH1000 e ressuspenda em 1,5 mL de PBS, correlacionando-se com uma concentração de bactérias de cerca de 2 x 108 UFC / mL. Mantenha as bactérias no gelo até o uso.
- Para verificar a concentração de bactérias, diluir 100 μL da amostra bacteriana 1:10.000 e 1:100.000 em PBS. Placa de alíquotas de 20 μL em uma placa de ágar. Incubar a 37 °C em uma incubadora umidificada por 16 h. Conte as UFC por exame macroscópico e calcule a concentração bacteriana no dia seguinte.
3. Ferimento cutâneo excisional e inoculação com S. aureus
- Administre 100 μL de cloridrato de buprenorfina 0,03 mg / mL (~ 0,2 mg / kg) a cada camundongo por meio de injeção intraperitoneal.
- Vinte minutos após a injeção, coloque 2-4 camundongos em uma câmara com 2-3 LPM de oxigênio com 2-4% de isoflurano. Assim que os camundongos estiverem totalmente anestesiados, transfira os camundongos um de cada vez para um cone nasal conectado a 2-3 LPM de oxigênio com 2-4% de isoflurano. Verifique se os ratos estão totalmente anestesiados, apertando firmemente cada pata traseira entre o polegar e o indicador. Prossiga para a próxima etapa se o animal não responder ao beliscão.
- Raspe uma seção de 1 polegada por 2 polegadas na parte de trás do mouse com uma tesoura elétrica e limpe a área de aparas de pele usando um lenço limpo ou gaze. Evite usar loção depilatória, pois pode causar excesso de inflamação.
- Limpe a parte de trás do mouse primeiro com gaze embebida em iodopovidona a 10% e depois com gaze embebida em etanol a 70%. Limpe a área em um padrão espiral, movendo-se para fora do centro da área cirúrgica. Aguarde aproximadamente 1 min para que a área cirúrgica seque antes da cirurgia.
- Segure a parte de trás raspada do mouse frouxamente entre dois dedos e pressione firmemente uma biópsia por punção estéril de 6 mm no centro da área cirúrgica preparada. Não puxe a pele esticada.
- Torça a biópsia por punção para criar um contorno circular na pele que corta totalmente a pele em pelo menos uma seção do contorno. Tenha cuidado para não cortar a fáscia ou tecido subjacente.
- Use tesouras e pinças estéreis para cortar a epiderme e a derme seguindo o padrão circular impresso pela biópsia por punção.
4. Inoculação de S. aureus
- Encha uma seringa de insulina de 28 G com o inoculante bacteriano bioluminescente desejado. Neste estudo, administre uma concentração de 1 x 108 UFC/mL (50 μL). Não administre mais de 100 μL de volume.
- Injete 50 μL de inoculante entre a fáscia e o tecido no centro da ferida nas costas do camundongo. Certifique-se de que o inoculante forme uma bolha no centro da ferida com vazamento ou dispersão mínima.
- Puxe a derme para o lado, segure a seringa quase paralela ao tecido e empurre lentamente a seringa para dentro do tecido até sentir uma diminuição repentina da resistência, o que indica perfuração da fáscia. Conduza cuidadosamente a seringa para o centro da ferida e dispense o inoculante lentamente. Remova a seringa lentamente do animal.
- Injetar o mesmo volume de PBS estéril nas feridas de animais não infectados, conforme descrito acima.
- Devolva o animal à sua gaiola. Coloque a gaiola sob uma lâmpada de calor ou em cima de uma almofada de aquecimento e monitore o animal até a recuperação da anestesia.
5. In Vivo BLI e FLI
- Inicialize todo o gerador de imagens de animais por meio do software do instrumento. Anestesiar camundongos em uma câmara que recebe oxigênio 2-3 LPM com 2-4% de isoflurano. Aplique anestesia nos narizes dentro do gerador de imagens.
- Coloque o rato ferido e infectado no gerador de imagens. Posicione o mouse de forma que a ferida seja o mais plana possível. Use a seguinte configuração de sequência para criar imagens dos mouses.
- Selecione Luminescência e Fotografia como o modo de imagem. O tempo de exposição é de 1 min em binning pequeno e F/stop 1 (luminescência) e F/stop 8 (fotografia). O filtro de emissão está aberto. Clique no botão Adquirir para gravar a imagem.
- Selecione Fluorescência e Fotografia como o modo de imagem. O tempo de exposição é de 1 s em binning pequeno e F/stop 1 (Fluorescência) e F/stop 8 (fotografia) com um comprimento de onda de excitação de 465/30 nm e um comprimento de onda de emissão de 520/20 nm com uma alta intensidade de lâmpada. Clique no botão Adquirir para gravar a imagem.
- Devolva o animal à sua gaiola e monitore-o até a recuperação da anestesia.
- Visualize os ratos diariamente, conforme descrito acima.
6. Análise de imagem
- Imagens abertas a serem quantificadas.
- Coloque uma grande região circular de interesse (ROI) em toda a área da ferida, incluindo a pele ao redor de cada camundongo na imagem. Os sinais de EGFP FLI in vivo de neutrófilos e os sinais de S. aureus BLI in vivo se estendem além da borda da ferida após vários dias e foram incluídos nesses estudos (Figuras 2A e 2B). Clique em Medir ROI e registre os valores do fluxo médio de cada mouse. Plote o fluxo médio de cada sinal (p / s) em relação ao tempo.
- Se um número absoluto de neutrófilos ou S. aureus na ferida for desejado, execute os seguintes experimentos.
- Para correlacionar o número de neutrófilos com os sinais FLI EGFP in vivo, enrole camundongos C57BL / 6J conforme descrito acima e transfira uma variedade de neutrófilos derivados da medula óssea (5 x 105 para 1 x 107) de doadores LysM-EGFP ou LysM-EGFPxMyD88-/- diretamente em cima de diferentes feridas. Imagem conforme descrito acima e correlacione os sinais FLI EGFP in vivo com a quantidade conhecida de neutrófilos.
- Para correlacionar S. aureus UFC com os sinais BLI in vivo, enrole e infecte camundongos conforme descrito acima. No dia 1, o registro pós-infecção in vivo dos sinais BLI dos camundongos e imediatamente sacrifica e resfria as carcaças. Extirpar a ferida, homogeneizar o tecido e aplicar diluições bacterianas em ágar para incubação durante a noite. No dia seguinte, conte as colônias para determinar a UFC por ferida.
- Para medir a cicatrização da ferida, ajuste uma ROI circular sobre a borda da ferida e meça a área da ferida (cm2) e plote a mudança fracionária da linha de base versus tempo (Figura 2C).
