Um método para induzir inflamação da superfície ocular em um modelo murino

Neste artigo

Resumo

Fonte: Singh, J., et al. Indução de inflamação da superfície ocular e coleta de tecidos envolvidos. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra um método para induzir inflamação da superfície ocular e disfunção da glândula meibomiana em um modelo murino. A estimulação do sistema imunológico do camundongo usando um imunógeno e a reestimulação posterior com o mesmo imunógeno promovem a inflamação da superfície ocular, o que causa o entupimento da secreção da glândula meibomiana por meio de aggNETs produzidos por neutrófilos e leva à doença do olho seco.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Indução de inflamação da superfície ocular murina

Realize a preparação do imunógeno para imunização.
1. Preparar o imunógeno na hora no dia da imunização, misturando ovalbumina (OVA, 50 mg/mL) e toxina da coqueluche (100 μg/mL) em soro fisiológico e o adjuvante hidróxido de alumínio (40 mg/mL) (ver Tabela de Materiais) na proporção de 1:1.
  cuidado: Realize a abertura, reconstituição e preparação do imunógeno da toxina da coqueluche em um gabinete de segurança laminar. Use roupas de proteção e evite qualquer contato com a pele.
2. Incube a mistura de imunógeno e adjuvante em temperatura ambiente por 30 min e carregue 100 μL em uma seringa de 1 mL.
3. Realize a injeção intraperitoneal da solução de imunógeno em um camundongo não anestesiado.
  1. Segure o mouse suavemente pela cauda enquanto segura a grade da gaiola. Segure firmemente a pele das costas e a região do pescoço entre o polegar e o indicador e fixe a cauda e os membros inferiores entre o dedo anelar e o dedo mínimo contra a palma da mão.
  2. Mantenha o mouse fixo com a cabeça para baixo.
  3. Injete 100 μL da solução de imunógeno preparada no quadrante direito ou esquerdo da cavidade abdominal inferior.
Realize o desafio da superfície ocular 2 semanas após a imunização.
1. Anestesiar o camundongo com isoflurano (2,5%).
2. Aplique 5 μL de OVA (50 mg / mL) ou solução salina (NaCl 0,9%) por olho em ambos os olhos e espere até que a gota seja absorvida pelo olho. Isso leva ~ 5 min.
3. Repita o procedimento 1x ao dia por 7 dias.
  nota: A administração tópica de medicamentos pode ser feita da mesma forma.

2. Coleção de exsudatos oculares

Recupere os exsudatos oculares formados durante a fase de provocação aplicando 50 μL de solução salina estéril no olho imediatamente após o desafio.

3. Excisão de tecidos da superfície ocular

Disseque as pálpebras e o globo ocular seguindo as etapas abaixo.
1. Eutanasiar o camundongo por asfixia por CO₂ e luxação cervical.
2. Coloque o mouse em uma superfície plana.
3. Desinfete a área orbital ao redor do olho com um cotonete impregnado com etanol a 70%.
4. Faça uma incisão entre a orelha e o seio retro-orbital e ao longo da superfície acima do osso escamoso verticalmente, estendendo a incisão horizontalmente abaixo da pálpebra inferior ao longo do osso maxilar e acima da pálpebra superior ao longo do osso frontal. Isso forma uma incisão ao redor do olho (Figura 1).
5. Segure cuidadosamente o tecido dissecado ao redor do olho usando uma pinça curva e puxe o tecido e o globo ocular para fora.
6. Coloque os órgãos excisados em PBS estéril.
7. Apare o excesso de tecido muscular facial ao redor das pálpebras superiores excisadas usando um bisturi e sob o microscópio estereoscópico.
Colete a conjuntiva seguindo os passos abaixo.
1. Coloque a pálpebra superior em uma placa de Petri seca sob o estereomicroscópio.
2. Usando uma pinça fina e um bisturi, retire a camada mucosa esbranquiçada com muito cuidado da superfície interna da pálpebra.
Em seguida, disseque a córnea seguindo as etapas abaixo.
1. Coloque o globo ocular em uma nova placa de Petri seca em cima de gelo seco por 3 min.
2. Leve a placa de Petri para a superfície da bancada em uma posição estável.
3. Faça uma pequena incisão na borda da córnea ao lado do limbo usando uma tesoura fina e afiada.
4. Prolongue a incisão com o bisturi ao redor do globo ocular, separando a esclera da córnea.
5. Remova os restos da íris e do cristalino da parte de trás da córnea, lavando generosamente com solução salina.

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Resultados

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Figura 1: Excisão do tecido facial ao redor da região orbitária.A trilha de incisão é indicada em vermelho. Isso permite a excisão dos órgãos oculares e a investigação da influência e dos efeitos de várias terapêuticas administradas topicamente em órgãos oculares acessórios, como a conjuntiva e a córnea.