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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Indução de inflamação da superfície ocular murina
- Realize a preparação do imunógeno para imunização.
- Preparar o imunógeno na hora no dia da imunização, misturando ovalbumina (OVA, 50 mg/mL) e toxina da coqueluche (100 μg/mL) em soro fisiológico e o adjuvante hidróxido de alumínio (40 mg/mL) (ver Tabela de Materiais) na proporção de 1:1.
cuidado: Realize a abertura, reconstituição e preparação do imunógeno da toxina da coqueluche em um gabinete de segurança laminar. Use roupas de proteção e evite qualquer contato com a pele.
- Incube a mistura de imunógeno e adjuvante em temperatura ambiente por 30 min e carregue 100 μL em uma seringa de 1 mL.
- Realize a injeção intraperitoneal da solução de imunógeno em um camundongo não anestesiado.
- Segure o mouse suavemente pela cauda enquanto segura a grade da gaiola. Segure firmemente a pele das costas e a região do pescoço entre o polegar e o indicador e fixe a cauda e os membros inferiores entre o dedo anelar e o dedo mínimo contra a palma da mão.
- Mantenha o mouse fixo com a cabeça para baixo.
- Injete 100 μL da solução de imunógeno preparada no quadrante direito ou esquerdo da cavidade abdominal inferior.
- Realize o desafio da superfície ocular 2 semanas após a imunização.
- Anestesiar o camundongo com isoflurano (2,5%).
- Aplique 5 μL de OVA (50 mg / mL) ou solução salina (NaCl 0,9%) por olho em ambos os olhos e espere até que a gota seja absorvida pelo olho. Isso leva ~ 5 min.
- Repita o procedimento 1x ao dia por 7 dias.
nota: A administração tópica de medicamentos pode ser feita da mesma forma.
2. Coleção de exsudatos oculares
- Recupere os exsudatos oculares formados durante a fase de provocação aplicando 50 μL de solução salina estéril no olho imediatamente após o desafio.
3. Excisão de tecidos da superfície ocular
- Disseque as pálpebras e o globo ocular seguindo as etapas abaixo.
- Eutanasiar o camundongo por asfixia por CO2 e luxação cervical.
- Coloque o mouse em uma superfície plana.
- Desinfete a área orbital ao redor do olho com um cotonete impregnado com etanol a 70%.
- Faça uma incisão entre a orelha e o seio retro-orbital e ao longo da superfície acima do osso escamoso verticalmente, estendendo a incisão horizontalmente abaixo da pálpebra inferior ao longo do osso maxilar e acima da pálpebra superior ao longo do osso frontal. Isso forma uma incisão ao redor do olho (Figura 1).
- Segure cuidadosamente o tecido dissecado ao redor do olho usando uma pinça curva e puxe o tecido e o globo ocular para fora.
- Coloque os órgãos excisados em PBS estéril.
- Apare o excesso de tecido muscular facial ao redor das pálpebras superiores excisadas usando um bisturi e sob o microscópio estereoscópico.
- Colete a conjuntiva seguindo os passos abaixo.
- Coloque a pálpebra superior em uma placa de Petri seca sob o estereomicroscópio.
- Usando uma pinça fina e um bisturi, retire a camada mucosa esbranquiçada com muito cuidado da superfície interna da pálpebra.
- Em seguida, disseque a córnea seguindo as etapas abaixo.
- Coloque o globo ocular em uma nova placa de Petri seca em cima de gelo seco por 3 min.
- Leve a placa de Petri para a superfície da bancada em uma posição estável.
- Faça uma pequena incisão na borda da córnea ao lado do limbo usando uma tesoura fina e afiada.
- Prolongue a incisão com o bisturi ao redor do globo ocular, separando a esclera da córnea.
- Remova os restos da íris e do cristalino da parte de trás da córnea, lavando generosamente com solução salina.
