Identificando inibidores de quinase que modulam a resposta do timócito a fortes sinais de TCR

Resumo

Fonte: Chen, E. W., et al. Identificação de mediadores da sinalização do receptor de células T por meio da triagem de bibliotecas de inibidores químicos. J. Vis. Exp. (2019).

Neste vídeo, descrevemos um método para identificar os inibidores de quinase de pequenas moléculas que modulam a apoptose de timócitos imaturos CD4⁺CD8⁺ duplo-positivos auto-reativos. A apoptose é induzida nos timócitos duplo-positivos, ativando-os com esferas magnéticas revestidas com anti-CD3 e anti-CD28; Isso é seguido por um tratamento com inibidores de moléculas pequenas e análise de citometria de fluxo para detectar se os inibidores modulam a expressão do marcador apoptótico.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Triagem da Biblioteca de Inibidores de Quinase (Ensaio independente de centrífuga)

1. Tratamento de timócitos com inibidores de quinase
   1. Prepare uma suspensão de timócitos.
   2. Diluir os timócitos em RPMI completo para obter uma suspensão de timócitos de 25 x 10⁶ células/ml.
   3. Adicione 40 μL de timócitos a cada poço de uma placa de pequeno volume, usando uma pipeta multicanal. Coloque o prato no gelo.
   4. Diluir os inibidores da placa padrão, DMSO e dexametasona em RPMI completo na proporção de quatro partes de RPMI completo para uma parte de inibidor/DMSO/dexametasona (fator de diluição de 5).
      nota: Como os volumes usados nesta placa de pequeno volume são 5x menores do que no método convencional, os inibidores e os reagentes de controle são diluídos cinco vezes antes de adicioná-los aos timócitos na placa.
   5. Adicione 0,5 μL de inibidores de quinase à placa de 96 poços dos poços correspondentes da placa inibidora preparada na etapa 1.1.4.
   6. Prepare oito poços de controles não tratados. Prepare quatro poços de controles tratados com veículos adicionando 0,5 μL do DMSO preparado na etapa 1.1.4. Prepare quatro alvéolos de controlos tratados com dexametasona a 5 μM, utilizando a dexametasona diluída preparada no passo 1.1.4 (figura 1).

2. Estimulação de timócitos com esferas anti-CD3/CD28

1. Certifique-se de que as contas sejam ressuspensas uniformemente. Pegue 1 mL de grânulos e lave-os com 2 mL de PBS. Separe as esferas usando um suporte magnético e aspire a solução. Ressuspenda os grânulos em 1 mL de RPMI.
   completo nota: A proporção de grânulos para células é de 1 para 2,5. Ajuste a quantidade de grânulos, dependendo do número de poços a serem estimulados e do número de timócitos usados.
2. Adicione 10 μL de suspensão de grânulo a cada amostra tratada com inibidor, as quatro amostras tratadas com DMSO e quatro das oito amostras não tratadas. Adicione 10 μL de RPMI completo aos quatro poços não tratados restantes. A Figura 1 mostra o layout geral da placa.
   nota: O volume final dos poços é de 50 μL, que está dentro da capacidade máxima dos poços. É importante ter cuidado e manter as placas na posição vertical, para evitar derramamento de poços cruzados.
3. Para misturar, agite a placa usando um agitador orbital de microplacas. Como alternativa, misture o conteúdo dos alvéolos usando uma pipeta multicanal.
4. Incubar os timócitos em uma incubadora de CO₂ a 37 °C, 5% por 17 a 20 h (ou durante a noite) com uma tampa antievaporação.

3. Configuração da arruela de placas

NOTA: As instruções para configurar a lavadora de placas são fornecidas pelo fabricante. As etapas são mencionadas brevemente abaixo. Aproximadamente 150 mL de solução são necessários para cada etapa de escorva.

1. Prepare o sistema de lavagem com etanol 70% contendo 1% Tween 20.
2. Prepare o sistema de lavagem com água deionizada contendo 1% de Tween 20.
3. Prepare o sistema de lavagem com tampão de lavagem FACS.

4. Coloração de antígenos de superfície

1. Prepare uma mistura de coloração de anticorpos contendo anticorpos anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 e anti-CD69. Diluir os anticorpos no tampão de lavagem FACS na proporção de 1:100 (v/v).
2. Lave a placa 9x, usando 55 μL de tampão de lavagem FACS por lavagem, usando o sistema automatizado de lavagem por fluxo laminar.
   nota: Ao final das lavagens, haverá 25 μL de volume residual em cada poço.
3. Ressuspenda as células em 25 μL da mistura de anticorpos de coloração preparada na etapa 1.4.1.
4. Se as amostras forem transferidas de uma placa de 96 poços, ressuspenda as células em 50 μL da mistura de anticorpos e transfira as amostras para a placa de pequeno volume. Esta etapa corresponde ao método número 2, conforme ilustrado na Figura 2A.
5. Para misturar, agite a placa com um agitador orbital de microplacas ou misture as amostras usando uma pipeta multicanal e incube no gelo por 30 min.

5. Fixação de células

1. Lave a placa 9x, usando 55 μL de tampão de lavagem FACS por lavagem, usando o sistema automatizado de lavagem por fluxo laminar.
2. Adicione tampão de fixação/permeabilização (vem com o kit de apoptose de caspase-3 ativo; o mesmo com o tampão de perm/lavagem 10x mencionado na etapa 1.6.1 e o anticorpo anti-caspase-3 na etapa 1.6.2) a 50 μL por poço.
3. Incubar no gelo por 30 min.

6. Coloração intracelular para caspase ativa 3

1. Prepare 1x permanente/tampão de lavagem diluindo 25 mL de 10x permanente/tampão de lavagem em 225 mL de água ultrapura.
2. Prepare a coloração de caspase ativa intracelular adicionando 1 mL de anticorpo anti-caspase-3 a 2 mL de 1x permanente/tampão de lavagem. A proporção de anticorpo para permanente/tampão de lavagem é de 1:2.
3. Prepare o sistema de lavagem com 1x permanente/tampão de lavagem.
4. Lave a placa 9x com 1x permanente/tampão de lavagem, a 55 μL para cada lavagem.
5. Adicione 25 μL da coloração de caspase intracelular preparada na etapa 1.6.2 a todos os poços.
6. Para misturar, agitar a placa com um agitador orbital de microplacas ou misturar as amostras com uma pipeta multicanal e incubar no gelo durante 1 h.
7. Lave a placa 9x com 1x permanente/tampão de lavagem, a 55 μL para cada lavagem.
8. Adicione 25 μL de tampão de lavagem FACS a todos os poços.
9. Transferir as amostras para tubos de microtitulação após mistura adequada por pipetagem.
10. Adicione mais 50 μL de tampão de lavagem FACS aos poços vazios e repita a etapa 1.6.9.
11. Repita as etapas 1.6.9 e 1.6.10 2x até que 200 μL das amostras sejam coletadas nos tubos de microtitulação.
    nota: O objectivo dos procedimentos descritos nos passos 1.6.10 e 1.6.11 é assegurar a recuperação máxima das células da placa de pequeno volume. Se o número de células não for uma preocupação, após a etapa 1.6.10, basta encher os tubos de microtitulação até 200 μL com tampão de lavagem FACS.
12. Execute uma análise de citometria de fluxo das amostras e analise os resultados com um programa de análise FACS. A ativação da caspase-3 e a expressão de CD69 são analisadas na porta contendo timócitos CD4+CD8+DP.

Resultados

Figura 1: Layout da placa do ensaio de ativação de timócitos. (Início) As colunas 1 e 12 são reservadas para controles, enquanto as colunas 2 a 11 são amostras tratadas com inibidores (bege). O controle negativo (não estimulado [NS]; cinza) ocupa os poços A1 a D1, e o controle positivo para morte celular (tratado com dexametasona [DEX]; roxo) ocupa os poços E1 a H1. As colunas 2 a 12 contêm timócitos estimulados com esferas anti-CD3...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI	HyClone	SH30027FS
FBS	HyClone	SH3007103
L-Glutamina	HyClone	SH3003401
Piruvato de sódio	HyClone	SH3023901
10X PBS	Vivantis	PB0344 – 1L
Biblioteca de triagem de quinase (96 poços)	Cayman Chemical	10505	O conteúdo exato da biblioteca pode variar
Dmso	Sigma Aldrich	D2650
dexametasona	Sigma Aldrich	D4902
grânulos anti-CD3/CD28	Thermo Fisher Científico	11452D
Kit de Apoptose Caspase-3 Ativa FITC	BD Pharmingen	Rolamento 550480	Contém tampão de fixação/permeabilização, tampão 10X Perm/Wash e anticorpo anti-caspase 3
Lavadora DA-Cell	CURIOX	HT1000
Placa de célula DA de 96 poços	CURIOX	96-DC-CL-05
Anticorpos
CD3e	BioLegend	100236
TCRb	BD Biociências	553174
CD4	BD Biociências	740007
CD8	BD Biociências	563786
CD69	eBiociência	25-0699-42
Inibidores
TG003	Cayman Chemical		Da Biblioteca de Triagem de Quinase
TG003	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
PKC 412	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Doramapimod	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Paclitaxel	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Erlotinibe	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Necrostatina-5	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
NVP-BEZ235	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Ftalazinone pyrazol	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AG-879	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
1-NA-PP1	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Torin 1	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Bisindolmaleimida II	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
BIBF 1120	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
SMI-4a	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Bisindolmaleimida XI (cloridrato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CAY10657	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AS-703026	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Cloreto de queleritrina	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Tuniamicina	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
GSK 1059615	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Ruxolitinibe	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Necrostatina-1	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
SB 505124	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
INK128	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Canertinibe (cloridrato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
SB 431542	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
PD 173074	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Ácido valpróico (sal de sódio)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
PD 0325901	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
SB 203580	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
VX-702	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Emodin	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CHIR99021	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
bio	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Imatinibe (mesilato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Malato de Sunitinibe	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Gefitinibe	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Pág. 2	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
3-metiladenina	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Bisindolmaleimida I	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Bisindolmaleimida IV	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Bisindolmaleimida V	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
NSC 663284	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
D 4476	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
NU 7026	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
H-9 (cloridrato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Indirrubina-3'-monóxido	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
KN-62	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
KN-93	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CGP 57380	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Iso-Olomoucina	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
(S)-Glicil-H-1152 (cloridrato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Bisindolmaleimida VIII (acetato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
ST638	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
SU 6656	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
LY364947	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
SB 203580 (cloridrato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CAY10621	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
YM-201636	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
ZM 447439	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AS-041164	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
NVP-AEW541 (cloridrato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
PÁG. 242	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
ABT-869	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CAY10622	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
17β-hidroxi Wortmannin	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CAY10626	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
SU 6668	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CAY10572	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
N,N-Dimetilesfingosina	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
LY294002	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
U-0126	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Estaurosporina	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
KN-92 (cloridrato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AS-605240 (sal de potássio)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
O-1918	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Y-27632 (cloridrato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Leelamina	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
PD 98059	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
PD 169316	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
TGX-221	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
(S)-H-1152 (cloridrato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AS-605240	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
D-eritro-esfingosina C-18	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
OSU03012	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
JNJ-10198409	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Leelamina (cloridrato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Leelamida de ácido araquidônico	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Leelamida de ácido láurico	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AS-252424	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CAY10505	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
PI-103	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
PIK-75 (cloridrato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Inibidor de Esfingosina Quinase 2	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Piceatanol	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
SC-1	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
(R)-Roscovitina	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
BAÍA-43-9006	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CAY10561	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AS-604850	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
PI3-Quinase α Inibidor 2	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
ML-9	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Triciribina	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Análogo de erbstatina	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Kenpaullone	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Olomoucine	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AG-494	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AG-825	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AG-1478	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
SB 216763	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
SB 415286	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AG-17	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
H-8 (cloridrato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
LFM-A13	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
SC-514	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Apigenina	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AG-18	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CAY10554	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
DRB	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
RG-13022	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
RG-14620	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AG-490	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AG-82	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AG-99	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AG-213	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AG-183	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Lavendustin C	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
ZM 336372	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
5-iodotubercidina	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
SB 202190	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CAY10571	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Nilotinibe	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
SP 600125	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
L-treo-esfingosina C-18	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
H-89	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
HA-1077 (cloridrato)	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AG-370	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Wortmannin	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
AG-1296	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
KT 5823	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Janex 1	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CAY10574	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CAY10575	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CAY10576	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
NH125	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
TWS119	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
NSC 210902	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CAY10577	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CAY10578	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
PD 184161	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
CCT018159	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase
Miricetina	Cayman Chemical	-	Da Biblioteca de Triagem de Quinase