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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Derivação e ativação de macrófagos da medula óssea com anticorpos
- Realize a eutanásia usando asfixia por CO2.
- Coloque o mouse na câmara de indução. Eutanasiar o camundongo com anestesia com isoflurano a 5%, por 60 a 90 s, até que fique imóvel e a respiração seja profunda e lenta.
- Desligue a anestesia com isoflurano e administre 6 - 8 L / min de CO2 até que o camundongo pare de respirar. Deixe o mouse com CO2 ligado por pelo menos mais 5 min. Verifique se não há mais batimentos cardíacos ou respiração. Realize uma luxação cervical para garantir a morte.
NOTA: Camundongos de 8 a 12 semanas de idade fornecem o maior rendimento de macrófagos.
- Pulverize as pernas do rato com etanol a 70% e prenda-as com os braços e as pernas esticados em decúbito dorsal sobre uma placa de espuma. Com tesoura e pinça para segurar a pele, faça um corte raso (0,2 cm) para remover a pele e o pelo da superfície de cada uma das patas traseiras.
nota: Realize este procedimento e todas as manipulações de cultura de tecidos em um capuz estéril.
- Apare o músculo para tornar as tíbias e fêmures visíveis. Remova as tíbias e fêmures, cortando o osso e os músculos logo abaixo da articulação do quadril e acima dos tornozelos. Apare o máximo de músculo possível.
- Pulverize os ossos com etanol a 70% e aguarde 1 minuto para evaporar, depois coloque-os em uma placa de 6 poços de meio de descarga óssea (meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), soro bovino fetal a 10% (FBS)).
- Apare as extremidades dos ossos cortando 0,1 cm de osso do tornozelo e da parte superior do fêmur para que a cavidade óssea fique exposta. Certifique-se de que a medula esteja visível e que uma agulha de calibre 26 possa ser colocada na cavidade óssea.
- Corte os ossos e músculos para separar as tíbias e fêmures das articulações do joelho. Insira uma agulha de calibre 26 conectada a uma seringa de 10 mL na cavidade. Lave a medula óssea em um tubo cônico de 50 mL com 5 mL de meio de lavagem óssea. Lave duas tíbias e dois fêmures, de um camundongo, em cada tubo de 50 mL.
- Pipete para cima e para baixo várias vezes ou vórtice a medula em uma velocidade lenta para dispersar suavemente os aglomerados. Os fios de medula devem ser divididos em pequenas manchas de medula (menos de 0,5 mm). Encha o tubo cônico até 50 mL com o meio de descarga óssea. Pipetar o conteúdo do tubo cónico para um balão de 75 cm2 tratado com cultura de tecidos e incubar a 37 °C, CO2 a 5% durante 1 h.
nota: Macrófagos maduros e células mesenquimais se tornarão aderentes ao frasco e serão descartados, enquanto os progenitores hematopoiéticos desejados permanecerão em suspensão.
- Pipetar o meio com progenitores hematopoiéticos para um tubo cónico de 50 ml. Centrifugue o tubo a 300 x g à temperatura ambiente por 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 5 mL de meio de cultura do fator estimulador de colônias de macrófagos (MCSF) (IMDM, 10% FBS, 5 ng/mL de MCSF, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina e 150 μM de monotioglicerol (MTG)).
- Conte as células usando um hemocitômetro. Adicione o meio para ressuspender as células a uma concentração de 0,5 x 106 células / mL, 1,5 x 107 células / frasco em 30 mL de meio e pipete para cima e para baixo suavemente. Pipetar 30 ml de suspensão para um novo balão de 75 cm2 tratado com cultura de tecidos.
- No dia 4 e no dia 7 após a cultura inicial na etapa 1.9, verifique se as células estão aderentes e ligeiramente ramificadas usando um microscópio de campo claro de contraste de fase invertido. Descarte o meio que contém as células não aderentes. Lave as células com IMDM uma vez e adicione 30 mL de meio de cultura MCSF.
- Quando as células estiverem maduras no dia 10 (>95% positivo para F4/80 e Mac-1), verifique novamente se as células estão aderentes e ligeiramente.
- Para plaquear as células para estimulação, remova o meio de cultura do frasco e adicione 8 mL de tampão de dissociação celular à base de EDTA sem enzimas (Tabela de Materiais). Incubar as células durante 5 min a 37 °C, 5% CO2.
- Raspe as células suavemente, com uma pequena quantidade de pressão, usando um raspador de células estéril. Verifique no microscópio se as células se desprenderam da superfície do frasco. Pipetar células dissociadas em um tubo cônico de 50 mL. Enxágue o frasco 3 vezes com 5 mL de IMDM e junte a solução de enxágue com as células que foram colhidas. Centrifugue as células a 300 x g à temperatura ambiente por 5 min.
- Ressuspenda o pellet celular em 3 mL de meio de cultura MCSF por tubo cônico de 50 mL. Conte as células viáveis usando um hemocitômetro. Ressuspenda as células a uma concentração de 1 x 106 células/mL e coloque 100 μL de suspensão celular (1 x 105 células/poço) por poço de uma placa de fundo plano tratada com cultura de tecidos de 96 poços.
nota: Ossos de um camundongo gerarão células suficientes para 100 poços. Se desejado, 1 mL de células pode ser plaqueado em uma placa de 6 poços (cultura de tecidos tratada, fundo plano). Um número maior de células (1 x 106 células) pode ser útil para análises de western blot.
- Uma vez aderente, estimule poços duplicados ou triplicados, cada um com 10 ng/mL de LPS no IMDM, 30 mg/mL de IVIg ou IVIg + LPS. Doses de LPS ou IVIg podem ser tituladas para otimizar as respostas. Deixe poços duplicados ou triplicados como controles não estimulados. Incubá-los por 24 h (37 °C, 5% CO2).
nota: As células replaqueadas devem aderir aos poços de cultura de tecidos dentro de 1 h.
- Colete sobrenadantes celulares de cada poço em tubos de microcentrífuga individuais de 1,7 mL e remova qualquer material particulado girando a 10.000 x g por 5 min.
- Remova o sobrenadante da célula e evite perturbar o pellet. Coloque o sobrenadante de célula clarificada em um tubo de microcentrífuga estéril.
nota: Os sobrenadantes celulares podem ser testados para citocinas, IL-10, e subunidade de citocinas, IL-12/23p40, por ensaio imunoenzimático (ELISA) imediatamente ou armazenados a -80 °C a longo prazo. Siga o protocolo ELISA de um kit disponível comercialmente (Tabela de Materiais). Outras citocinas pró-inflamatórias podem ser testadas, como IL-6 e TNF, pois também são reduzidas pelo co-tratamento com estimulação IVIg + LPS em comparação com a estimulação apenas com LPS. Após a estimulação, as células aderentes podem ser preparadas para técnicas como western blotting ou reação em cadeia da polimerase quantitativa (Q-PCR).