Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Camundongos desafiadores in vivo com imunoglobulina intravenosa e lipopolissacarídeo (IVIg+LPS) e colheita de macrófagos peritoneais
- Pese cada rato. Calcule o volume de IVIg (concentração estoque de 100 mg / mL) necessário para fornecer uma dose final de 2,5 g / kg de peso corporal. Calcule a quantidade de LPS (concentração estoque de 100 μg/mL no meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM)) necessária para fornecer uma dose final de 0,2 μg/g de peso corporal.
nota: Por exemplo, para um camundongo de 20 g, são necessários 500 μL de solução estoque de IVIg e 40 μL de uma solução de 100 μg/mL de LPS.
- Aspire a quantidade necessária de IVIg e LPS para uma seringa estéril de 1 mL equipada com uma agulha estéril de calibre 26. Para camundongos controle que não receberão IVIg, substitua um volume equivalente de IVIg por solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4.
- Scruff o mouse com uma mão, agarrando sua pele na parte de trás do pescoço com o polegar e o dedo indicador e segurando a cauda e as patas traseiras com os dedos restantes. Incline seu corpo em direção ao chão.
- Coloque a agulha em um ângulo de 30 a 40 ° em relação ao abdômen do camundongo, no quadrante inferior direito, incline para cima e insira 1,5 cm. Injete o IVIg + LPS, ou PBS + LPS, por via intraperitoneal.
- Após 1h, realizar a eutanásia com asfixia por dióxido de carbono (CO2).
- Coloque o mouse em uma câmara de indução. Eutanasiar o camundongo com anestesia com isoflurano a 5%, por 60 a 90 s, até que fique imóvel e a respiração seja profunda e lenta.
- Desligue a anestesia com isoflurano e administre 6-8 L/min de CO2 até que o camundongo pare de respirar. Deixe o mouse com CO2 ligado por pelo menos mais 5 min. Verifique se não há mais batimentos cardíacos ou respiração. Realize uma luxação cervical para garantir a morte.
NOTA: Camundongos de 8 a 12 semanas de idade fornecem o maior rendimento de macrófagos.
- Prenda o mouse em uma placa de espuma, com os membros espalhados. Pulverize as peças com etanol 70%.
nota: Execute o procedimento em um capuz estéril.
- Faça um corte raso na pele (0,2 cm) com uma tesoura ao longo da linha média do mouse, para evitar cortar a cavidade peritoneal. Puxe a pele abdominal da barriga do camundongo usando uma pinça, para que o revestimento da parede peritoneal intacta fique visível.
- Encha uma seringa de 5 ml com 5 ml de PBS estéril (pH 7,4). Insira uma agulha de calibre 25 ou 27 na parte superior da cavidade do lado esquerdo ou direito em direção ao centro do mouse com o chanfro da agulha para cima.
nota: Coloque a agulha cuidadosamente no camundongo para não injetar PBS nos órgãos, mas sim no espaço peritoneal.
- Empurre o fluido para dentro da cavidade peritoneal. Puxe a agulha para fora da cavidade e massageie o peritônio por 10 s para desalojar as células. Insira a agulha na parte superior da cavidade e evite órgãos. Colete e coloque o fluido de lavagem recuperado em um tubo cônico de 15 mL sobre gelo.
nota: Para cada 5 mL de fluido injetado, aproximadamente 3,75 mL serão recuperados.
- Repita a injeção e recuperação (etapas 1.8 - 1.9) mais 3 vezes (volume total de injeção de 20 mL), para recuperar 15 mL de fluido de lavagem no total. Colete a lavagem de cada camundongo em um tubo cônico separado de 15 mL.
nota: Após a injeção final, pode ser mais fácil extrair o fluido dos lados esquerdo e direito do camundongo, onde o fluido se acumulou. Os órgãos causarão menos interferência com a agulha nesta posição.
- Gire as células para baixo a 300 x g por 5 min a 4 °C. Remova 1 mL de fluido de lavagem recuperado e use para análises de interleucina ou IL-10 e IL-12/23p40 por ensaio imunoenzimático (ELISA) de acordo com as instruções do fabricante ou congele a -80 °C para análises futuras.
nota: Para garantir a comparação precisa entre os tratamentos para análise de citocinas do fluido de lavagem, realize lavagens de 5 mL da cavidade peritoneal 4 vezes para um volume final de 15 mL. Nem todo o fluido será recuperado de cada descarga.
- Ressuspenda as células em 500 μL de meio de plaqueamento (IMDM, soro bovino fetal 10%, FBS e 100 U / mL de penicilina / estreptomicina) por camundongo lavado. Contagem de macrófagos viáveis.
nota: Os macrófagos serão ligeiramente maiores que as outras células peritoneais. O rendimento típico é de 5 x 105 - 1 x 106 macrófagos/camundongo usando um camundongo C57BL/6 do tipo selvagem.
opcional: Se um grande número de glóbulos vermelhos estiver presente no pellet celular, execute uma etapa de lise de acordo com as instruções do fabricante para removê-los.
- Ressuspenda as células no meio de plaqueamento a 1 x 10,6 macrófagos/mL e coloque 100 μL por poço em uma placa tratada com cultura de tecidos de fundo plano de 96 poços.
nota: Pode ser necessário agrupar células de mais de um camundongo para um experimento. Por exemplo, se um camundongo tivesse 5 x 105 macrófagos, seriam necessários 500 μL de meio de plaqueamento.
- Incubar células por 1 h a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir que os macrófagos se tornem aderentes. As células aderentes são os macrófagos peritoneais. Remova os sobrenadantes celulares e as células não aderentes. Enxágue os poços duas vezes com 200 μL de IMDM (pré-aquecido a 37 °C), aguarde 10 s e incline lentamente a placa. Substitua o meio de revestimento. Incubar as células a 37 °C, 5% de CO2 durante 30 minutos antes da estimulação.
- Uma vez aderente, estimule os poços duplicados ou triplicados, cada um com 10 ng/mL de LPS no IMDM, 30 mg/mL de IVIg ou IVIg+LPS. Doses de LPS ou IVIg podem ser tituladas para otimizar as respostas. Deixe poços duplicados ou triplicados como controles não estimulados. Incubá-los por 24 h (37 °C, 5% CO2).
nota: As células replaqueadas devem aderir aos poços de cultura de tecidos dentro de 1 h. As amostras podem ser utilizadas imediatamente ou congeladas e armazenadas a -80 °C para análise de citocinas por ELISA.
- Colete sobrenadantes celulares de cada poço em tubos de microcentrífuga individuais de 1,7 mL e remova qualquer material particulado girando a 10.000 x g por 5 min.
- Remova o sobrenadante da célula e evite perturbar o pellet. Coloque o sobrenadante de célula clarificada em um tubo de microcentrífuga estéril.
nota: Os sobrenadantes celulares podem ser testados para citocinas, IL-10 e subunidade de citocinas, IL-12 / 23p40, por ELISA imediatamente, ou armazenados a -80 ° C a longo prazo. Siga o protocolo ELISA do kit disponível comercialmente (Tabela de Materiais). Outras citocinas pró-inflamatórias podem ser testadas, como IL-6 e fator de necrose tumoral (TNF), pois também são reduzidas pelo co-tratamento com estimulação IVIg+LPS em comparação com estimulação apenas com LPS. Após a estimulação, as células aderentes podem ser preparadas para técnicas como western blotting ou reação em cadeia da polimerase quantitativa (Q-PCR).
