Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Imunização de camundongos
- Prepare uma mistura principal de vacinas em um tampão fisiológico estéril, como solução salina ou DPS.
nota: O volume total na mistura deve incluir 10% a mais do que o necessário para a imunização de todo o grupo. As concentrações da composição da vacina são descritas a seguir nos passos 1.1.1 e 1.1.2. Transporte os itens para o viveiro no gelo.
- Para estudos de B. pertussis, inclua os seguintes grupos de vacinas: vacina contra coqueluche acelular (aPV) e aPV + fator de colonização por Bordetella A (BcfA). Além disso, use alúmen, antígenos vacinais isolados (hemaglutinina filamentosa (FHA) e pertactina (Prn)) e camundongos virgens (não imunizados) como grupos controle.
NOTA: aPV é 1/5da dose humana de um aPV aprovado pela FDA, que é composto de toxóide tetânico, toxóide diftérico reduzido, toxóide convulso (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA) e pertactina (Prn) adsorvida a sais de alumínio. Uma dose humana de aPV atual da coqueluche é de 0,5 mL, portanto, 1/5 de uma dose é de 0,1 mL. Os volumes para aPV + BcfA são 0,1 mL do aPV (1/5da dose humana) + 0,046 mL de BcfA (30 μg) por camundongo. O volume máximo que pode ser entregue com segurança a um músculo é de 0,1 mL. Como o volume da vacina aPV + BcfA é maior que 0,1 mL, a vacina deve ser administrada em ambos os ombros, divididos aproximadamente igualmente, para ser administrada com segurança.
- Para preparar uma vacina experimental, para uma dose, combine 1 μg de FHA e 0,5 μg de Prn com 50 μg de gel de hidróxido de alumínio em PBS estéril. Deixe o aPV experimental se misturar em um rolo de laboratório por 15 min à temperatura ambiente (RT). Em seguida, gire o tubo a 18.000 x g por 5 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante e ressuspenda o conteúdo em 1 mL de PBS estéril.
- No biotério, montar o aparelho de anestesia (Figura 1).
nota: Certifique-se de que haja níveis adequados de oxigênio e isoflurano em seus respectivos tanques antes de usar. Pesar o recipiente de isoflurano e substituí-lo quando o seu peso aumentar em 50 g.
- Limpe completamente o gabinete de segurança biológica (BSC) e coloque a câmara de indução limpa dentro do BSC. Conecte as linhas de anestesia e limpeza da máquina de anestesia à câmara de indução. Abra o tanque de oxigênio através do regulador para garantir que o oxigênio esteja fluindo e ajuste o nível para 1.5-2 L/min.
- Coloque os ratos da idade desejada (6-12 semanas) na câmara de indução. Ligue o isoflurano a 2,5-3% para anestesiar levemente os camundongos. Monitore os animais até que eles não estejam se movendo na câmara e sua respiração tenha diminuído.
- Teste o nível de indução beliscando os dedos dos pés, observando qualquer movimento reflexivo. Se não houver nenhum, os mouses estão prontos para injetar.
NOTA: Neste experimento, toda a gaiola de animais foi anestesiada de uma só vez. Pode-se optar por anestesiar os animais individualmente para injeção ou injetar os animais sem anestesia. Qualquer um desses métodos é apropriado.
- Enquanto isso, prepare seringas de insulina de 1 mL (28G1/2) com 0,1 mL de vacina cada. Quando os animais estiverem totalmente induzidos, remova um animal da câmara e coloque o camundongo ventralmente em uma toalha ou almofada de banco.
- Administre a vacina por via intramuscular. Com a seringa em um ângulo de 45° e com o chanfro voltado para cima, insira a seringa ~5 mm no deltóide do camundongo e injete a vacina.
nota: O quarto traseiro/flanco pode ser usado como local de injeção em vez do deltoide.
- Após a injeção, mantenha a agulha inserida no músculo por ~ 5-10 s. Assim que o volume for fornecido, gire a seringa em 180° para que o chanfro fique voltado para longe para criar uma vedação e evitar o vazamento da vacina. Em seguida, puxe lentamente a agulha para fora do local da injeção.
- Retorne o mouse para a gaiola. Repita o procedimento com todos os animais do grupo designado.
- Desligue o isoflurano e lave a câmara de indução com oxigênio antes de anestesiar a próxima gaiola de camundongos.
- Monitore os animais até que estejam todos alertas e se movendo na gaiola. Retorne a gaiola ao local de alojamento.
- Monitore os animais a cada 12 h após a vacinação, até 48 h, quanto a sintomas clínicos de morbidade, como pelagem áspera/despenteada, marcha lenta ou dificuldade para respirar. Se os sintomas persistirem, consulte o veterinário institucional e remova os camundongos do estudo, se necessário.
- Quatro semanas após a imunização inicial, aumente os camundongos anestesiando e administrando injeções intramusculares no deltóide direito do camundongo com a mesma formulação de vacina que foi administrada anteriormente.
- Novamente, monitore o animal quanto a quaisquer sintomas clínicos. Animais domésticos por mais 2 semanas e depois prossiga com a infecção.
2. Modelo de Infecção Intranasal Murina
- No biotério, defina as condições de oxigênio e anestesia conforme descrito nas etapas 1.3 e 1.4. Conforme descrito na etapa 1.5, coloque os ratos na câmara para anestesiar. Monitore os animais até que a anestesia faça efeito.
- Quando os camundongos estiverem anestesiados, remova um animal de cada vez da câmara de indução. Pegue o rato pela nuca do tórax dorsal, atrás das omoplatas e pescoço. Posicione o mouse na vertical para acessar o nariz.
- Usando uma ponta de pipeta de 200 μL, aplique lentamente 40-50 μL do inóculo bacteriano de B. pertussis nas narinas do camundongo (20-25 μL em cada nare). Segure o camundongo até que todo o inóculo tenha sido inalado pelo animal. Se parte do inóculo borbulhar, colete as bolhas e instile-as novamente nas narinas. Forneça uma quantidade igual de PBS estéril a um grupo de camundongos como controle negativo.
- Como feito nas etapas 1.10-1.12, retorne os animais inoculados à gaiola e monitore os animais até que estejam alertas e em movimento. Retorne a gaiola de volta ao seu espaço de alojamento original no rack. Lave a câmara de indução com oxigênio para remover o isoflurano residual antes de anestesiar o próximo conjunto de animais. Monitore os animais por 48 h após a infecção.
- No laboratório, diluições seriadas em placas do inóculo, em PBS estéril, para verificar as unidades formadoras de colônias (UFCs) reais entregues aos camundongos. Placa 0,1 mL de diluições em placas de 10% de BG + Sm (placas de ágar Bordet-Gengou suplementadas com 10% de sangue de ovelha desfibrinado e 100 μg/mL de estreptomicina) (Figura 2A). Colocar as placas na incubadora a 37 °C e crescer durante 4 dias. Contar e calcular as UFC a partir do inóculo entregue ao ratinho (figura 2B).
3. Colheita de tecido animal após infecção
- Prepare-se para a dissecção do camundongo e a colheita de tecidos.
- Esterilize todas as ferramentas (tesouras grossas e finas, tesouras curvas, pinças finas, pilões de pellets e espalhadores triangulares) necessárias para processar tecidos em autoclave. Sele as ferramentas em bolsas de esterilização. Enrole os homogeneizadores de vidro em papel alumínio e adicione fita de autoclave para indicar esterilidade.
- Prepare placas de ágar 1 ou 2 dias antes da colheita do tecido para garantir que as placas estejam solidificadas antes do uso. Para B. pertussis, use 10% BG + Sm. Placas de etiqueta para o pulmão para cada camundongo com as diluições desejadas, determinadas empiricamente para cada experimento.
- Encher e rotular os tubos de diluição de UFC. Adicione 0,9 mL de PBS estéril aos tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mL com base no número de órgãos a serem processados e diluições por órgão.
- Tubos de enchimento e etiqueta para coleta de tecidos:
- Pulmões: adicione 2 mL de caseína estéril a 1% em PBS a um tubo cônico estéril de 15 mL e armazene a 4 °C. Para colher pulmões para histologia, adicione 2 mL de formalina tamponada neutra a 10% (NBF) e armazene-a em RT.
- Etanol fresco a 70% deve ser preparado para encher copos e frascos de spray para dissecação.
- Transporte todos os materiais para o biotério em um carrinho no dia da colheita. Limpe o BSC e configure a máquina de anestesia conforme as etapas 1.3 e 1.4.
- Coloque os camundongos a serem dissecados na câmara de indução e, com o fluxo de oxigênio, ligue o isoflurano a 5% e espere até que os animais estejam inconscientes. Remova os camundongos um de cada vez e desloque o animal cervical como método secundário para garantir a morte. Após a luxação cervical, a eutanásia deve ser confirmada pela ausência de frequência respiratória e/ou ausência do reflexo de retirada (teste de pinça do dedo do pé).
- Posicione o mouse, com o lado ventral voltado para cima, na placa de dissecação e prenda os braços e as pernas abertos. Pulverize o corpo do camundongo com etanol 70%.
- Usando uma pinça, aperte a pele abaixo do abdômen, no centro da pelve. Usando uma tesoura afiada, faça um corte vertical até a mandíbula. Em seguida, disseque a pele para longe da parede peritoneal afastando as duas camadas, usando pequenos movimentos com a tesoura fechada. Coloque a pele nas laterais da carcaça para criar um campo desobstruído para a colheita de órgãos estéreis.
- Use uma pinça para estabilizar a caixa torácica no processo xifóide e abra o diafragma. Os pulmões devem esvaziar e cair em direção à coluna. Abra a caixa torácica nas laterais para remover o peitoral.
- Isole e remova o lobo superior do pulmão direito, cortando as artérias e veias pulmonares. Coloque o lóbulo em um tubo cônico de 15 mL contendo 10% de NBF e coloque o tubo em RT por pelo menos 24 h para fixar o tecido. Isole os lobos restantes do pulmão direito e do pulmão esquerdo. Coloque os lóbulos em um tubo cônico de 15 mL contendo 2 mL de caseína a 1% em PBS e coloque-o no gelo.
- Descarte a carcaça em um saco de risco biológico. Antes de dissecar o próximo animal, lave as ferramentas com água deionizada e coloque-as em um copo cheio de etanol a 70%. Remova as ferramentas, sacuda o excesso de etanol e prossiga com a próxima dissecação.
- Disseque cada mouse seguindo as etapas mencionadas acima.
- Processe os tecidos conforme descrito abaixo.
4. Processamento de Pulmões
- Transfira os pulmões (em 2 mL de caseína a 1% em PBS) para um homogeneizador Dounce estéril de 15 mL. Use um pilão para homogeneizar o tecido. Dissocie até que não restem grandes partículas de tecido. Colocar a suspensão homogeneizada de volta no tubo original de 15 ml.
- Remover uma alíquota de 0,3 ml para o revestimento de UFC e centrifugar o homogeneizado a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Recolher e alíquota do sobrenadante em alíquotas de 0,5 ml para tubos de microcentrífuga pré-marcados. Armazenar as amostras a -20 °C até à análise das citocinas por ELISA.
- Preparar as diluições escolhidas diluindo em série 0,1 ml da suspensão pulmonar homogeneizada em tubos de diluição (0,9 ml de PBS estéril). Coloque 0,1 mL de diluições empiricamente escolhidas em placas pré-marcadas com 10% BG + Sm e espalhe usando um espalhador triangular estéril.
- Incubar as placas a 37 °C em ar ambiente durante 4 dias.
- Contagem e cálculo de UFC/pulmão (Figura 3). Resumidamente, multiplique os números de UFC recuperados pelo fator de diluição da placa e, em seguida, também pelo volume total em que o órgão foi processado. Os cálculos de UFC são então transformados em valores de Log10 para cada animal e representados graficamente.
- Placas com 30-300 colônias são contadas com facilidade e precisão. Placas com menos de 6 colônias não devem ser usadas para cálculos, pois esse baixo número de colônias introduz erros. Para obter um limite inferior de detecção, o volume total no qual um órgão foi homogeneizado é dividido pelo volume usado para detectar em uma placa do homogenato não diluído (por exemplo, 2 mL de volume total dividido por 0,1 mL de homogenato não diluído é igual ao limite inferior de 20 UFC detectáveis).
