NOTA: As etapas a seguir foram realizadas usando células B IIA1.6.
1. Ativação de células B com grânulos revestidos de antígeno
- Preparação de esferas revestidas de antígeno
- Para ativar as células B, use NH2-beads covalentemente revestidos com antígeno (grânulos revestidos com Ag), que são preparados usando 50 μL (~ 20 x 106 beads) de 3 μm NH2-beads com antígenos ativadores (BCR-ligante +) ou não ativadores (BCR-ligante-).
- Para células B IIA1.6, use o fragmento anti-IgG-F(ab')2 como ligante-BCR+ e anti-IgM-F(ab')2 ou albumina de soro bovino (BSA) como ligante-BCR-. Para ativar células B primárias ou linhagem de células B IgM+, use anti-IgM-F(ab')2 como ligante BCR+ e BSA como ligante BCR-.
nota: Para evitar a ligação de ligantes ao receptor Fc, use fragmentos de anticorpos F(ab') ou F(ab')2 em vez de anticorpos de comprimento total.
- Para prosseguir com a preparação de grânulos revestidos com Ag, coloque-os em tubos de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas para maximizar a recuperação dos grânulos durante a manipulação da amostra. Adicione 1 mL de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) para lavar as esferas e centrifugue a 16.000 x g por 5 min. Aspire o sobrenadante.
- Ressuspender os grânulos com 500 μL de glutaraldeído a 8% para ativar os grupos NH2 e girar por 4 h em temperatura ambiente (TR).
cuidado: A solução-mãe de glutaraldeído só deve ser usada em uma capela de exaustão química. Siga as instruções na ficha de dados de segurança do material (MSDS).
- Centrifugue os grânulos a 16.000 x g por 5 min, remova o glutaraldeído e lave os grânulos mais três vezes com 1 mL de 1x PBS.
cuidado: A solução de glutaraldeído deve ser descartada como resíduo químico perigoso.
- Ressuspenda os grânulos ativados em 100 μL de 1x PBS. A amostra pode ser dividida em dois tubos de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas: 50 μL para o BCR-ligante+ e 50 μL para BCR-ligante-.
- Para preparar a solução de antigénio, utilizar dois tubos de microcentrífuga de 2 ml de baixa ligação às proteínas, contendo 100 μg/ml de solução de antigénio em 150 μl de PBS: um tubo com BCR-ligante+ e outro com BCR-ligante-.
- Adicionar 50 μl de solução de grânulos activados a cada tubo contendo 150 μl de solução de antigénio, vórtice e rodar durante a noite a 4 °C.
- Adicione 500 μL de 10 mg / mL de BSA para bloquear os grupos NH2 reativos restantes nos grânulos e gire por 1 h a 4 ° C.
- Centrifugue os grânulos a 16.000 x g por 5 min a 4 ° C e remova o sobrenadante. Lave as contas com PBS frio 1x mais três vezes.
- Ressuspenda os grânulos ativados em 70 μL de 1x PBS.
- Para determinar a concentração final de grânulos revestidos com Ag, dilua um pequeno volume de grânulos em PBS (1:200) e conte usando um hemocitômetro. Em seguida, conservar a 4 °C até à utilização.
nota: Os grânulos revestidos com Ag não devem ser armazenados por mais de 1 mês.
2. Preparação de lamínulas de poli-L-lisina
- Antes do ensaio de ativação de células B com grânulos revestidos com Ag, prepare lamínulas revestidas com poli-L-lisina (lamínulas PLL). Use um tubo de 50 mL contendo 40 mL de solução de PLL a 0,01% p / v e mergulhe as lamínulas de 12 mm de diâmetro na solução. Gire durante a noite em RT.
- Lave as lamínulas com 1x PBS e deixe secar em uma tampa de placa de 24 poços coberta com filme de parafina. Prossiga com a ativação das células B.
3. Ativação de células B
- Para iniciar a ativação das células B com grânulos, primeiro dilua a linha celular IIA1.6 B para 1,5 x 106 células/mL em meio CLICK (RPMI-1640 suplementado com 2 mM de L-Alanina-L-Glutamina + 55 μM de beta-mercaptoetanol + 1 mM de piruvato + 100 U/mL de Penicilina + 100 μg/mL de estreptomicina) + 5% de soro fetal bovino inativado pelo calor [FBS]).
- Combine 100 μL (150.000 células) de células IIA1.6 B com grânulos revestidos com Ag na proporção de 1:1 em tubos de 0,6 mL. Misture delicadamente usando um vórtice e semeie em lamínulas de PLL. Incubar para diferentes pontos de tempo em uma incubadora de cultura de células (37 °C / 5% CO2). Os pontos de tempo de ativação típicos são 0, 30, 60 e 120 min. Para o tempo 0, coloque as lamínulas PLL na tampa da placa de 24 poços no gelo. Adicione a mistura de células revestidas com Ag e incube por 5 min em gelo.
nota: É importante misturar por vórtice em vez de pipetar para cima e para baixo, pois isso pode reduzir o número de grânulos na amostra, devido ao seu acúmulo na ponta plástica da pipeta. Use grânulos revestidos com ligante BCR como controle negativo para cada ensaio. Recomendamos ativar primeiro o tempo de incubação mais longo e depois os pontos de tempo seguintes. Calcule os intervalos de ativação das amostras de modo a que estejam simultaneamente prontas para a fixação.
- Adicione 100 μL de PBS 1x frio a cada lamínula para interromper a ativação e continuar com o protocolo de imunofluorescência.
