Ativação de células B em uma lamínula revestida com antígeno

Resumo

Fonte: Ibañez-Vega, J., et al., Estudando a dinâmica das organelas nas células B durante a formação da sinapse imune. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a ativação de células B in vitro. O processo envolve a interação do antígeno com os receptores de células B, levando à remodelação do citoesqueleto, formação de sinapses imunes, movimento de lisossomos, internalização de antígenos, processamento e subsequente apresentação em moléculas de MHC para ativação de células B.

Protocolo

1. Preparação de lamínulas de poli-L-lisina

1. Antes do ensaio de ativação de células B com grânulos revestidos com Ag, prepare lamínulas revestidas com poli-L-lisina (lamínulas PLL). Use um tubo de 50 mL contendo 40 mL de solução de PLL a 0,01% p / v e mergulhe as lamínulas de 12 mm de diâmetro na solução. Gire durante a noite em RT.
2. Lave as lamínulas com 1xPBS e deixe secar em uma tampa de placa de 24 poços coberta com filme de parafina. Prossiga com a ativação das células B.

2. Ativação de células B em lamínulas revestidas com antígeno

1. Preparação de lamínulas revestidas de antigénio
   1. Antes da ativação, prepare a solução de antígeno (1x PBS contendo 10 μg/mL de ligante BCR+ e 0,5 μg/mL de camundongo anti-camundongo de rato CD45R/B220).
   2. NOTA: Considere preparar as lamínulas no dia anterior ao ensaio. O B220 melhora a adesão das células B, no entanto, o BCR-Ligand+ é suficiente para gerar a resposta de espalhamento.
   3. Coloque a lamínula de 12 mm em uma tampa de placa de 24 poços coberta com filme de parafina, adicione 40 μL de solução de antígeno em cada lamínula e incube a 4 ° C durante a noite. Feche a placa para evitar a evaporação da solução de antígeno.
   4. Lave as lamínulas com 1x PBS e seque ao ar.
2. Ativação de células B
   1. Para iniciar a ativação, dilua as células B IIA1.6 para 1,5 x 10⁶ células/mL em meio CLICK + 5% de FBS.
   2. Adicione 100 μL de células a uma lamínula revestida com antígeno (Ag-lamínula) e ative para diferentes pontos de tempo em uma incubadora de células a 37 °C / 5% CO₂. Os pontos de tempo de ativação típicos são 0, 30 e 60 min.
      nota: Como na seção 1, recomendamos começar com o ponto de tempo de ativação mais longo para corrigir todas as amostras ao mesmo tempo.
   3. Para o tempo 0, coloque a tampa da placa de 24 poços contendo a lamínula de Ag no gelo e adicione as células. Incube por 5 min no gelo.
   4. Aspire cuidadosamente o meio em cada lamínula de Ag e, em seguida, adicione 100 μL de PBS 1x frio para interromper a ativação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
IIA1.6 (variante A20) células de linfoma B de camundongo	ATCC	TIB-208	Linfoma murino de células B de origem Balb/c que expressa um BCR contendo IgG em sua superfície sem FcγIIR
CaCl2	Winkler	CA-0520
glicina	Winkler	BM-0820
HyClone Soro fetal bovino	Thermo Fisher Científico	SH30071.03	Inativar o calor a 56 C por 30 min
Kcl	Winkler	PO-1260
NaCl	Winkler	SO-1455
Parafilme	O	Pág. 1150-2
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher Científico	15140122	líquido
Poli-L-lisina	sigma	Pág. 8920	Diluir com água estéril
RPMI-1640	Indústrias Biológicas	01-104-1A
Piruvato de sódio	Thermo Fisher Científico	11360070
Tubo 50 ml	Corning	353043
2-mercaptoetanol	Thermo Fisher Científico	21985023
glutamina	Thermo Fisher Científico	35050061
Anticorpo IgG anti-camundongo de cabra	Jackson ImmunoResearch	315-005-003	Ligante positivo IIA1.6