Efeito do anticorpo anti-C-fms na osteoclastogênese em células da medula óssea de camundongos in vitro

Resumo

Fonte: Marahleh, A., et al. Efeito do anticorpo anti-c-fms na formação e proliferação de osteoclastos J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, demonstramos o efeito de diferentes concentrações de anticorpos anti-c-fms na osteoclastogênese, que é o processo de formação de osteoclastos a partir de progenitores de osteoclastos.

Protocolo

1. Geração de BMM

1. Semeie 1 x 10⁷ células/10 mL em uma placa de cultura de 10 cm e adicione M-CSF 100 ng/mL. A concentração final de M-CSF é de 100 ng/mL de meio de cultura. Incubar a cultura a 37 °C, 5% de CO₂ durante 3 dias.
2. Após 3 dias, remova o meio de cultura, lave as células vigorosamente com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes para remover as células não aderentes, adicione 5 mL de temperatura ambiente 0,02% de tripsina-EDTA em PBS e incube a 37 ° C, 5% CO₂ por 5 min.
3. Separe as células por pipetagem completa. Certifique-se de que as células foram destacadas observando a cultura ao microscópio (as células devem parecer arredondadas e flutuando no meio). Se as células permanecerem presas, repita a pipetagem completamente para separá-las. Quando as células estiverem separadas, adicione 5 mL de α-MEM para inativar a reação.
4. Recolha as células num tubo cónico de 50 ml e centrifugue a 300 xg durante 5 min. Elimine o sobrenadante e lave com 5 ml de α-MEM.
5. Centrifugue a 300 x g por 5 min e ressuspenda o pellet em 10 mL de α-MEM.
6. Execute uma contagem de células.
7. Semeie 1 x 10⁶ células/10 mL em uma placa de cultura de 10 cm e adicione M-CSF 100 ng/mL. A concentração final de M-CSF é de 100 ng/mL de meio de cultura. Incubar a cultura a 37 °C, 5% de CO₂ durante 3 dias.

2. Geração de osteoclastos a partir de BMM como precursores de osteoclastos

1. Após 3 dias, colha as células anexas que representam o BMM como precursores de osteoclastos, seguindo as etapas 1.2-1.7.
2. Semeie BMM a 5 x 10⁴ células/200 μL de α-MEM em uma placa de 96 poços. Adicione RANKL para uma concentração final de 50 ng/mL ou TNF-α para uma concentração final de 100 ng/mL. Adicione M-CSF para uma concentração final de 100 ng/mL a cada poço.
3. Adicione anticorpo anti-c-fms (concentrações finais de 0, 1, 10, 100, 1000 ng / mL) a cada poço.
4. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ por 4 dias. Mude de mídia a cada dois dias por 4 dias.

3. Fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP)

1. Após 4 dias de incubação, aspire suavemente o meio de cultura de cada poço. Lave cada poço uma vez com 200 μL de temperatura ambiente 1x PBS.
2. Adicione 200 μL de formalina a 10% a cada poço para fixação e incube por 1 h em temperatura ambiente. Aspire a formalina e lave cada poço 3 vezes com água deionizada.
3. Adicione 200 μL de Triton X-100 a 0,2% em PBS a cada poço para permeabilização e incube por 1 h em temperatura ambiente. Aspire o Triton X-100 e lave cada poço 3 vezes com água deionizada.
4. Adicione 200 μL de solução de coloração TRAP a cada poço. Visualize a mancha ao microscópio. Levará de 10 a 30 minutos para que a mancha se desenvolva adequadamente.
5. Aspire a mancha e lave cada poço com água deionizada 3 vezes e seque ao ar. Mantenha-o em temperatura ambiente para uso em observação posterior.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-c-FMS			AFS98, um anticorpo monoclonal, antimurino, c-Fms de rato (IgG2a)
RANKL	PEPROTECH	315-11	Ligante sRANK murino recombinante, Fonte: E.coli
M-CSF			M-CSF humano recombinante. 1/10 vol de sobrenadante de cultura de linha celular CMG14–12 a 5X106 células em uma placa de cultura em suspensão de 10 cm.
α-MEM	Wako		com L-Glutamina e vermelho de fenol
Soro fetal bovino	Biooeste	S1820-500	Soro Fetal Bovino Origem Francesa
Prato de cultura	Corning		Prato estilo 100 mm x 20 mm
Placa de 96 poços	Thermofisher Científico		Clone de freira Superfície Delta