1. Infecção viral em Drosophila
- Infectar moscas por nano-injeção e realizar ensaios de sobrevivência.
- Puxe os capilares para preparar as agulhas de injeção, encha a agulha de injeção com óleo e monte o injetor.
- Anestesiar moscas na plataforma sob um fluxo leve de CO2. Inocular moscas por injeção intratorácica de 50,6 nL de solução viral (100 PFU, diluído com tampão Tris-HCl, pH 7,2). Injete pelo menos 3 frascos para injetáveis de moscas (20 moscas por frasco).
nota: A injeção é demorada (geralmente 100 moscas por hora) e a replicação do vírus Drosophila C (DCV) é muito rápida, por isso é muito importante anotar o tempo exato no tubo depois de terminar cada frasco (20 moscas). A injeção somente de buffer é definida como um controle fictício. Normalmente, as moscas adultas machos são preferidas, pois os resultados são mais estáveis e reprodutíveis do que quando se usa fêmeas, uma vez que as variações hormonais durante o acasalamento e a reprodução podem influenciar a leitura das fêmeas.
- Cultive as moscas injetadas a 25 °C, 60% de umidade em um ciclo normal de claro/escuro. Forneça às moscas alimentos frescos diariamente e registre o número de moscas mortas.
- Realize pelo menos 3 réplicas biológicas e trace a curva de sobrevivência.
- Para a análise estatística dos dados de sobrevida, gerar curvas de sobrevida de Kaplan-Meier por software estatístico. Execute um teste de log-rank para calcular os valores de P. Na tabela de sobrevivência, insira as informações de cada sujeito. O software então calcula a porcentagem de sobrevivência em cada momento e traça um gráfico de sobrevivência de Kaplan-Meier.
nota: NÃO adicione fermento adicional ao frasco para injetáveis. Em comparação com os controles simulados, as moscas infectadas com DCV ocasionalmente têm ascite e são desajeitadas, o que as torna vulneráveis a leveduras pegajosas. É melhor registrar mais pontos de tempo no experimento preliminar para descobrir um período de tempo em que a morte em massa acontecerá para moscas infectadas. Geralmente, as moscas infectadas raramente morrem nos primeiros dois dias, mesmo para as linhagens mutantes Dicer-2. Para a mosca w1118 livre de Wolbachia (Bloomington 5905) infectada com 100 PFU de DCV, essa janela de tempo é de cerca de 3-5 dias após a infecção. As moscas-das-frutas que morrem dentro de 0,5 h após a injeção não devem ser contadas como uma fatalidade, pois podem ser mortas por ferimentos causados por agulhas e não por infecção viral.
2. Medição da carga de DCV por ensaio de efeito citopático (CPE)
- No dia 1, infecte as moscas machos conforme descrito nas etapas 1.1.1-1.1.2. Agrupe as moscas injetadas em grupos de 20 e mantenha-as crescendo com alimentos frescos para moscas pelo tempo desejado (normalmente por 24 horas ou 3 dias). Forneça às moscas alimentos frescos diariamente.
- No dia 2, semeie as células Drosophila S2 * em uma placa de cultura de células de 10 cm com a densidade de aproximadamente 5 x106 a 1x107 células / mL.
- No dia 3, colete 5 moscas (sob um leve fluxo de CO2) e triture-as em um tubo de centrífuga de 1,5 mL por 30 s com 200 μL de tampão Tris e esferas de cerâmica usando um homogeneizador. Armazene as amostras a -80 °C ou prossiga imediatamente para a próxima etapa.
- Vortex completo a amostra. Use uma seringa de 1 mL e um filtro de 0,22 μm para filtrar o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.
- Efectuar diluições seriais de 10 vezes do sobrenadante com meio completo para as células S2*. Adicione diluições de 50 μL no poço. Adicionar 50 μL de meio de cultura sem vírus ao poço classificado como poço controle negativo.
nota: Para cada taxa de diluição, foram utilizados 8 poços. Como o rendimento típico do DCV é de cerca de 108-10 9 PFU/mL, a diluição deve cobrir pelo menos ~10-5-10-10.
- No dia 4, observe o CPE com um microscópio de campo claro com uma objetiva de 20X ou 40X. Classifique um poço em que as células parecem embaçadas e o meio está cheio de fragmentos como um "poço positivo", e um poço em que a morfologia celular é normal como um "poço negativo".
- Marque os poços CPE positivos ou negativos com + ou –, respectivamente. Calcular a dose infecciosa média de cultura de tecidos virais (TCID50).
3. Carga DCV medida por qRT-PCR
- No dia 1, infecte as moscas conforme descrito acima. Agrupe moscas machos injetadas (20 moscas/grupo) e cultive-as em alimentos frescos para moscas pelo tempo desejado, normalmente por 24 horas ou 3 dias. Forneça às moscas alimentos frescos diariamente.
- No dia 3, colete 5 moscas sob um fluxo leve de CO2 em um tubo de 1,5 mL com 200 μL de tampão de lise e 20 esferas de cerâmica (diâmetro = 0,5 mm) e triture as amostras por homogeneizador com alta velocidade por 30 s. Adicione 800 μL de tampão de lise adicional a cada tubo e armazene as amostras a -80 ° C ou conduza imediatamente a extração de RNA e qRT-PCR.
- Prepare ponteiras, tubos e água deionizada, tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) e filtrada por membrana de 0,22 μm sem RNase. Adicione 200 μL de clorofórmio (≥99,5%) à amostra e agite vigorosamente por 15 s com a mão. Incubar por 5 min ou mais em temperatura ambiente até que a fase aquosa e a fase orgânica estejam claramente separadas.
nota: O clorofórmio é extremamente perigoso e deve ser manuseado com cuidado. NÃO faça vórtice na amostra, o que aumentará o risco de contaminação do DNA.
- Centrifugue amostras a 13.000 x g por 15 min a 4 °C.
- Colete 400 μL de sobrenadante e transfira o sobrenadante para novos tubos. Misture com o mesmo volume de isopropanol (≥ 99,5%), inverta suavemente as amostras 20 vezes à mão e, em seguida, precipite por 10 min ou mais em temperatura ambiente.
nota: A precipitação a -20 °C aumentará o rendimento do RNA.
- Centrifugue amostras a 13.000 x g por 10 min a 4 °C. Pastilhas de RNA branco são visíveis no fundo do tubo.
- Descarte o sobrenadante e adicione 1 mL de etanol a 70% (etanol em água DEPC) e inverta algumas vezes para lavar o RNA.
- Centrifugar amostras a 13.000 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o RNA sobrenadante e seco durante 5-10 min; O RNA deve se tornar transparente.
- Adicione 50 μL de água DEPC à amostra, pipete algumas vezes e vortex.
- Tome 3 μL de RNA para titular a concentração de RNA. Quantificar o RNA a 260 nm. Normalmente, a concentração de RNA extraída por este protocolo é de aproximadamente 100-500 μg/μL, o que é adequado para a síntese de cDNA.
- Use 2 μg de RNA para síntese de cDNA. Diluir a amostra a 100 μL com ddH2O e conservar a -20 °C.
- Execute o qRT-PCR de acordo com as instruções do fabricante e execute o qRT-PCR.
nota: Para a síntese de cDNA de DCV, os primers aleatórios funcionaram muito melhor do que os primers Poly A. A expressão do mRNA do DCV é normalizada para o mRNA endógeno da proteína ribossômica 49 (rp49). Oligonucleotídeos usados nesta parte:
rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (para frente) e
5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (reverso);
DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (para frente) e
5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (reverso);
vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (para frente) e
5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (reverso);
RNA 1 induzido por vírus (vir-1) 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (direto) e
5' GATTACAGCTGGGTGCACAA 3' (reverso).