Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de Camundongos e DSS
- Mantenha os camundongos knockout (α-gustducina-/-) e os camundongos C57BL/6 de controle do tipo selvagem (α-gustducina+/+) pareados por idade, sexo e peso corporal individualmente em gaiolas limpas.
nota: Os camundongos knockout foram retrocruzados com camundongos C57BL / 6 por mais de 20 gerações e têm um fundo genético quase 100% C57BL / 6.
- Dissolva 30 g de pó de sulfato de dextrano sódico (DSS) em 1 L de água autoclavada. Misture até que a solução fique clara para garantir que a concentração final de trabalho seja de 3% (p / v).
nota: A solução DSS pode ser conservada à temperatura ambiente até 1 semana ou a 4 °C até à utilização.
2. Indução e avaliação da colite DSS em camundongos
- Pese e registre o peso corporal inicial de cada camundongo. Coloque os ratos individualmente em gaiolas de plástico padrão e etiquete as gaiolas.
- Substitua a água potável regular por uma solução de DSS a 3% por um total de 7 dias, aos quais ambos os grupos de camundongos tenham acesso ad libitum.
- Meça o peso corporal do camundongo, registre o consumo da solução DSS e colete e examine as fezes de cada camundongo diariamente durante a administração do DSS. Observe a gravidade da diarreia e do sangramento retal e converta-a no índice de doença induzido por DSS.
- Durante o experimento, calcula-se o percentual de perda de peso em relação ao peso inicial e o índice da doença para avaliar os sintomas da colite.
nota: O índice da doença é pontuado pela combinação de observações de diarreia e sangramento retal e é definido da seguinte forma: 0 (fezes normais, sem sangue), 1 (fezes moles, sem sangue), 2 (fezes moles, pouco sangue), 3 (fezes muito moles, sangramento modesto) e 4 (fezes aquosas, sangramento significativo). O índice da doença é analisado diariamente para cada camundongo.
- Ao final do tratamento DSS de 7 dias, sacrifique os camundongos por luxação cervical e prossiga com os experimentos restantes.
3. Preparação de Amostras de Tecido
- Coloque o camundongo em decúbito dorsal e limpe a pele do abdômen com etanol a 70%. Faça uma incisão na linha média de 3 cm de comprimento no abdômen com uma tesoura pequena para expor a cavidade abdominal.
- Use um par de pinças para separar cuidadosamente o baço de outros tecidos, remova o baço e meça seu tamanho.
- Identifique e levante o cólon com uma pinça e separe-o do mesentério circundante. Puxe todo o cólon até que o ceco e o reto estejam visíveis.
- Isole o cólon cortando-o na margem colonocecal e profundamente na pelve para liberar o cólon proximal e distal, respectivamente. Em seguida, meça e registre o comprimento do cólon isolado. Tenha cuidado para não danificar o tecido colônico durante o procedimento de dissecação.
- Lave o cólon com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada com uma seringa de 10 mL equipada com uma agulha de gavagem para remover as fezes e o sangue até que o eluído esteja completamente limpo.
- Para identificação histológica, divida as amostras de tecido igualmente em três partes: proximal, média e distal. Em seguida, fixe o tecido com paraformaldeído (PFA) a 4% durante a noite a 4 °C.
4. Avaliação histológica da gravidade da colite induzida por DSS
- Coloração de hematoxilina e eosina (H&E)
- Após a fixação, mergulhe o tecido em uma solução de sacarose a 30% em 1x PBS durante a noite em um tubo de 15 mL para crioproteger as amostras.
- Incorpore o tecido em um composto de temperatura de corte ideal (OCT) e coloque-o a -20 °C até que o OCT endureça.
- Transferir o bloco OCT contendo o tecido para um criostato, ajustar o botão de espessura no criostato para 12 μm e cortar e recolher secções congeladas de 12 μm de espessura.
- Aquecer as secções de tecido recolhidas de um criostato a 65 °C durante 20 min numa placa quente.
- Lave as seções brevemente em água destilada. Pinte-os com solução de coloração de hematoxilina por 5 min e, posteriormente, enxágue com água corrente da torneira por 5 min.
- Diferencie as seções com ácido clorídrico-etanol a 0,5% por 30 s e enxágue-as em água corrente da torneira por 1 min. Em seguida, realize a lavagem em 1x PBS por 1 min e posteriormente enxágue com água corrente da torneira por 5 min.
- Realize a lavagem das seções de tecido em álcool 70%, 75%, 80% e 95%, cada uma por 10 s. Contra-coloração em solução de coloração de eosina por 2 min.
- Realize a desidratação com álcool 95% e 2 trocas de álcool absoluto por 5 minutos de cada vez. Limpe em 2 trocas de xileno por 5 min.
- Pontue o dano tecidual do cólon proximal, médio e distal de cada camundongo para os grupos de nocaute genético e tipo selvagem com base nos resultados da coloração H & E acima.
nota: O índice da doença é uma pontuação combinada de dano epitelial e inflamação nas regiões mucosa, submucosa, muscular e serosa, que é definida da seguinte forma: 0 (sem dano tecidual e inflamação), 1 (dano tecidual focal e inflamação), 2 (dano tecidual irregular e inflamação) e 3 (dano tecidual difuso e inflamação). Três pontuações por camundongo para as partes proximal, média e distal do cólon são então somadas para obter uma pontuação total para cada animal. As pontuações médias para cada grupo são então calculadas.
