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Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Isolamento de monócitos humanos e diferenciação em macrófagos
- Obter sangue anticoagulado de indivíduos saudáveis não identificados em um banco de sangue regional e isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) conforme indicado abaixo.
nota: Execute todas as etapas em uma capela de fluxo laminar de cultura de tecidos. Use apenas tubos estéreis e use luvas. Adicione 10% de alvejante a todos os produtos relacionados ao sangue ao descartar. Solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) (1x) ou solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) (sem Ca2+ e Mg2+) podem ser usadas de forma intercambiável.
- Prepare o tampão de diluição: Suplemento 1x PBS estéril com 2% de soro fetal bovino (FBS) e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 mM.
- Prepare o meio de cultura: Suplemente o meio RPMI-1640 com FBS (10% (v/v)), glutamax (2 mM) e Penicilina/Estreptomicina (50 UI/50 μg/mL)
- Pré-resfrie o buffer de funcionamento (Tabela de Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.
- Diluir o sangue total com dois volumes de tampão de diluição. Usando uma pipeta sorológica, transfira 15 mL do sangue anticoagulado para um tubo de 50 mL contendo 30 mL do tampão de diluição. Misture delicadamente por inversão.
- Para cada 10 mL de sangue total ou 30 mL de sangue diluído, adicione 15 mL do meio gradiente de densidade a um tubo vazio de 50 mL.
- Camada do meio de gradiente de densidade da etapa 1.1.5 com 30 mL de sangue diluído lenta e continuamente usando uma pipeta sorológica de 25 mL. Mantenha a ponta da pipeta contra a parede do tubo e o tubo em um ângulo inclinado.
- Transfira cuidadosamente os tubos para uma centrífuga de balde oscilante. Evite perturbar as duas fases. Centrifugar os tubos a 400 x g à temperatura ambiente (RT) durante 25 min com aceleração e desaceleração definidas para o valor mínimo.
- Remova cuidadosamente a camada de plasma superior (transparente) usando uma pipeta de 10 mL e descarte-a em um recipiente com água sanitária (10%).
- Colete a camada interfásica (branca) de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs, Figura 1) com uma pipeta de 10 mL e transfira para um novo tubo de 50 mL. Combine a camada branca de diferentes tubos do mesmo doador em um tubo de 50 mL até 30 mL.
- Levar cada tubo a um volume total de 50 ml com o tampão de diluição do passo 1.1.1 e centrifugar a 300 x g e 4 °C durante 10 min. Retirar o sobrenadante com uma pipeta de 10 ml e deitá-lo num recipiente com lixívia (10%).
- Ressuspenda cada pellet de célula em 1 mL do tampão de funcionamento pré-resfriado da etapa 1.1.3 usando uma micropipeta p1000. Combine suspensões celulares do mesmo doador em um novo tubo de 15 mL. Traga o volume de cada tubo para 15 mL com tampão de corrida pré-resfriado e misture bem por inversão.
- Pegue uma alíquota de 20 μL da suspensão celular da etapa 1.1.11 e prepare uma diluição de 1:100 usando 1x PBS estéril. Determine o número de células usando um hemocitômetro.
- Centrifugar a suspensão de células da etapa 1.1.11 a 300 x g e 4 °C durante 10 min e remover o sobrenadante com uma pipeta de 10 ml. Se necessário, use uma micropipeta p200 para remover completamente o sobrenadante.
- Ressuspenda os PBMCs isolados em 80 μL de tampão de execução MACS pré-resfriado para cada 1 x 107 células, somando um máximo de 800 μL do tampão.
- Adicione 20 μL de microesferas CD14 anti-humanas por cada 1 x 107 células ou até 100 μL por amostra de sangue (~ 100 mL de sangue não diluído). Misturar bem por inversão e colocar sobre um rotador de tubos durante 20 min com mistura contínua a 4 °C.
- Remova as amostras do rotador do tubo, adicione 10 mL de tampão de funcionamento pré-resfriado a cada tubo e centrifugue a 300 x g (aceleração = 5, desaceleração = 5) e 4 ° C por 10 min.
- Remova o sobrenadante com uma pipeta de 10 mL e ressuspenda até 1 x 108 células em 500 μL de tampão de funcionamento pré-resfriado (2 x 108 / mL).
- Realize o isolamento de células CD14-positivas por classificação magnética de células usando um sistema manual ou automatizado (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
- Tomar uma alíquota de 20 μL da suspensão celular da etapa 1.1.18 após a seleção positiva para CD14 e preparar uma diluição de 1:100 usando 1x PBS estéril. Determine o número de células contando as células em um hemocitômetro.
- Centrifugue as células CD14-positivas a 300 x g e RT por 10 min. Remova o sobrenadante usando uma pipeta de 10 mL ou um sistema de vácuo.
- Ressuspenda o pellet celular da etapa 1.1.20 em um meio de cultura pré-aquecido da etapa 1.1.2 até uma densidade celular final de 1 x 107 células/mL.
- Semeie os monócitos CD14-positivos isolados com uma densidade celular de 5 x 106 células.
- Em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm, adicione 10 mL de meio de cultura da etapa 1.1.2 suplementado com 50 ng/mL de fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF).
- Adicione 0,5 ml da suspensão celular do passo 1.1.21 ao meio de cultura gota a gota e agite suavemente a placa. Incubar as células em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada (37 ° C, 5% CO2) durante a noite.
- No dia seguinte, aspire o meio usando um sistema de vácuo para remover as células que não se fixaram durante a noite. Adicione 10 mL de meio de cultura fresco suplementado com GM-CSF (50 ng / mL) e incube as células em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada (37 ° C, 5% CO2) por 7 dias para permitir a diferenciação completa (ver Figura 2A para o aparecimento de monócitos CD14 + em vários estágios de diferenciação em GM-CSF). Troque o meio de cultura a cada 2-3 dias e suplemente com GM-CSF fresco (50 ng/mL) de cada vez.
2. Preparação de componentes de eletroporação
NOTA: Este protocolo foi projetado para uma ponta de néon de 10 μL (Tabela de Materiais). Para cada transfecção, use 1-2 x 105 células. Recomenda-se semear células transfectadas em uma placa de 48 poços ou em uma placa com câmara de 8 poços (10 μL de células transfectadas por poço). 1x DPBS estéril (sem Ca2+ e Mg2+) pode ser usado no lugar do PBS.
- No dia 7, prepare um meio livre de antibióticos suplementando o meio RPMI-1640 com FBS (10% (v/v)) e glutamax (2 mM).
- Coloque o meio RPMI-1640 sem soro, a solução de tripsina-EDTA (0,25%), 1x PBS estéril (sem Ca2+ e Mg2+) e o meio de cultura completo da etapa 1.1.2 em banho-maria a 37 °C.
- Se estiver usando placas com fundo de vidro (para microscopia confocal), cubra as placas com bromidrato de poli-D-lisina.
- Cubra uma placa de 8 poços com 200 μL de bromidrato de poli-D-lisina (0,1 mg / mL em PBS estéril 1x) e incube por 5 min em RT.
- Aspire a solução de poli-D-lisina e lave o vidro uma vez com 1x PBS estéril. Aspire o PBS e prossiga com a etapa 2.4.
- Adicione 200 μL de meio livre de antibióticos por poço da placa de 48 poços ou 8 placas bem compartimentadas e pré-incube em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada (37 ° C, 5% CO2) até que esteja pronto para plaquear as células transfectadas.
3. Preparação de células para eletroporação
NOTA: O rendimento de MDM de um prato de 10 cm no final do período de diferenciação de 7 dias é de aproximadamente 1,5 x 106 células. 1x DPBS estéril (sem Ca2+ e Mg2+) pode ser usado no lugar do PBS. Este protocolo foi otimizado para que a maioria dos macrófagos seja destacada da placa com a manutenção da viabilidade e integridade celular. O MDM é difícil de separar das placas de cultura de células. Portanto, pode ser necessário executar as etapas 3.2 e 3.3 duas vezes para dissociar as células. Certifique-se de que cada tempo de incubação com tripsina-EDTA (0,25%) não exceda 5 min.
- Aspirar os meios de macrófagos totalmente diferenciados em placas de 10 cm e lavar a monocamada celular com meio RPMI-1640 quente e isento de soro. Certifique-se de remover completamente o meio.
- Colha as células adicionando 2 mL de solução quente de tripsina-EDTA (0,25%) por prato de 10 cm e incube em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada (37 ° C, 5% CO2) por 5 min.
- Complete o descolamento celular pipetando suavemente a solução de tripsina-EDTA (0,25%) para cima e para baixo em toda a área do prato usando uma micropipeta p1000. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de meio de cultura completo quente da etapa 1.1.2.
- Leve a antena parabólica a um microscópio de campo claro e verifique se há descolamento celular em vários campos de visão. Se ainda houver uma quantidade considerável de células ligadas, repita os passos 3.2-3.3.
- Centrifugar a suspensão celular a 250 x g durante 5 min à RT.
- Aspire o meio e ressuspenda as células em 10 mL de PBS 1x estéril pré-aquecido a 37 ° C. Pegue uma alíquota de 20 μL para determinar o número de células usando um hemocitômetro.
- Pegue 1-2 x 105 células por transfecção pretendida e coloque em um tubo de 15 mL. Leve a um volume final de 15 mL com PBS estéril 1x pré-aquecido. Centrifugue a 250 x g por 5 min em RT.
- Aspirar o PBS e centrifugar mais uma vez durante 1 min a 250 x g. Remova qualquer PBS residual do pellet celular usando uma micropipeta p200.
4. Nucleofecção de componentes da caspase BiFC em macrófagos derivados de monócitos humanos
NOTA: Esta seção do protocolo é realizada usando o Sistema de Transfecção Neon (Tabela de Materiais). Este protocolo descreve as etapas para transfectar 1-2 x 105 células usando uma ponta de néon de 10 μL (Tabela de Materiais). Se estiver usando uma ponta Neon de 100 μL, aumente a escala de acordo. Evite expor as células ao tampão de ressuspensão R por mais de 15 min, pois isso pode diminuir a viabilidade celular e a eficiência da transfecção.
- Dilua o plasmídeo repórter (ou seja, mCherry ou dsRedmito a 100 ng/μL) em água livre de nuclease ou tampão TE 0,5x para visualizar as células transfectadas.
- Dilua os plasmídeos BiFC de caspase a uma concentração apropriada em água livre de nuclease ou tampão TE 0,5x, de modo que o volume total de plasmídeos não exceda 30% do volume total de transfecção de 10 μL (ou seja, 300 ng/μL de C1 Pro-VC e 300 ng/μL de C1 Pro-VN).
- Prepare um microtubo estéril de 1,5 mL por transfecção pretendida e adicione a quantidade apropriada de plasmídeo repórter (ou seja, 50 ng ou 0,5 μL) e plasmídeos BiFC de caspase (ou seja, 300 ng ou 1 μL de C1 Pro-VC e 300 ng ou 1 μL de fragmento C1 Pro-VN). Mantenha os microtubos no capô o tempo todo.
- Coloque a estação de pipeta, o dispositivo, as pontas, os tubos de eletroporação e a pipeta em uma capela de fluxo laminar estéril.
nota: A estação de pipeta, dispositivo, pontas, tubos de eletroporação e pipeta estão incluídos no Sistema de Transfecção Neon.
- Conecte o alto voltage e o conector do sensor na estação de pipeta às portas traseiras do dispositivo de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha a estação de pipeta perto do dispositivo.
- Conecte o cabo de alimentação à entrada CA traseira e prossiga para conectar o dispositivo à tomada elétrica. Pressione o botão liga/desliga para ligar o dispositivo.
- Insira os parâmetros de transfecção na tela de inicialização exibida quando o dispositivo é ligado e conectado adequadamente. Pressione Voltage, digite 1000 e pressione Done para definir o voltage para 1000 V. Pressione Largura, digite 40 e pressione Concluído para definir a duração do pulso para 40 ms. Por fim, pressione # Pulsos, digite 2 e pressione Concluído para definir o número de pulsos elétricos para 2.
- Pegue um dos tubos de eletroporação (fornecidos no kit) e encha-o com 3 mL de tampão eletrolítico E (para pontas de 10 μL e fornecido no kit) em RT. Insira o tubo de eletroporação no porta-pipetas na estação de pipetas. Certifique-se de que o eletrodo na lateral do tubo esteja voltado para dentro e que um som de clique seja ouvido quando o tubo for inserido.
- Pegue o pellet celular da etapa 3.8 e adicione 10 μL de tampão R de ressuspensão pré-aquecido (fornecido no kit) para cada 1-2 x 105 células. Misture delicadamente com uma micropipeta p20. Adicione 10 μL da suspensão celular a cada tubo configurado na etapa 4.3 e misture suavemente com uma micropipeta p20.
- Pegue a pipeta e insira uma ponteira pressionando o botão Push na segunda parada. Certifique-se de que o clamp pega completamente a haste de montagem do pistão na ponta e que nenhuma folga é observada na cabeça superior da pipeta.
- Para aspirar a amostra, pressione o botão Push na pipeta até a primeira parada e mergulhe-a no primeiro tubo contendo a mistura de DNA célula / plasmídeo. Aspire lentamente a mistura para a ponta da pipeta.
nota: Evite bolhas de ar, pois elas podem causar arco durante a eletroporação e, se detectadas pelo dispositivo, podem impedir a entrega do pulso elétrico. Se forem observadas bolhas de ar, libere o conteúdo no tubo e tente aspirar novamente.
- Insira a pipeta com a amostra com muito cuidado no porta-pipetas. Certifique-se de que a pipeta se encaixa e que está colocada corretamente.
- Pressione Iniciar na tela sensível ao toque e aguarde até que os pulsos elétricos sejam fornecidos. Uma mensagem na tela indicará a conclusão.
- Remova lentamente a pipeta da estação e adicione imediatamente a suspensão de células transfectadas no poço correspondente com meio livre de antibióticos pré-aquecido da etapa 2.4 pressionando lentamente o botão até a primeira parada.
nota: Esta ponta pode ser reutilizada até três vezes para o mesmo plasmídeo; caso contrário, descarte-o em um recipiente de resíduos de risco biológico pressionando o botão Push até a segunda parada.
- Repita as etapas 4.10-4.14 para cada tubo contendo uma mistura de DNA de célula/plasmídeo.
- Agite suavemente a placa com células transfectadas e incube por 1-3 h em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada (37 ° C, 5% CO2).
- Adicionar a cada alvéolo 200 μL de meio de cultura pré-aquecido (meio completo) do passo 1.1.2. Coloque o prato na incubadora de cultura de tecidos umidificado (37 °C, 5% CO2) novamente. Aguarde pelo menos 24 h para a expressão gênica.
- No dia seguinte, inspecione a viabilidade celular e a eficiência da transfecção usando um microscópio de epifluorescência.
- Ligue o microscópio de epifluorescência e a caixa da fonte de luz fluorescente de acordo com as instruções do fabricante e coloque a placa de cultura no microscópio stage.
- Selecione a objetiva de 10x ou 20x e o filtro de 568 nm (RFP).
- Para estimar a viabilidade da célula, pressione o botão LED de luz transmitida (TL) para visualizar todas as células no campo selecionado. Enquanto olha para a ocular do microscópio, gire o botão de foco até que as células sejam observadas e verifique se há fixação de células no campo selecionado.
nota: As células totalmente ligadas representam as células viáveis, enquanto as células flutuantes representam as células não viáveis. Se a confluência do poço for alta, a presença de células não aderidas pode ser o resultado de uma superestimação do número de células e não o resultado de baixa viabilidade. No entanto, a baixa confluência acompanhada por um alto teor de células flutuantes significa baixa viabilidade que pode resultar de arco durante a eletroporação, toxicidade do plasmídeo ou superexposição ao tampão R de ressuspensão. Não use poços que exibam o último comportamento.
- Para estimar a eficiência da transfecção, concentre-se nas células no campo selecionado sob luz transmitida, conforme descrito acima. Conte o número total de células no campo selecionado. Com o LED de luz transmitida (TL) desligado, pressione o botão LED de luz refletida (RL) para ligar.
- Concentre-se na fluorescência do gene repórter (glóbulos vermelhos) e conte o número total de células fluorescentes vermelhas. Repita essas etapas (4.18.4-4.18.5) para pelo menos mais dois campos por poço.
5. Tratamento de MDM transfectado e aquisição de dados de caspase BiFC
NOTA: Se estiver planejando obter imagens das células usando um microscópio de epifluorescência ou confocal, o tratamento com qVD-OPh (20 μM) por 1 h antes do tratamento com o estímulo escolhido é aconselhado para evitar a morte celular dependente de caspase (predominantemente apoptose). Isso é usado em imagens para evitar que as células se decolem devido à apoptose, tornando-as muito difíceis de visualizar à medida que se movem para fora do plano focal. Observe que o recrutamento de caspases para a plataforma de ativação e a caspase BiFC associada não depende da atividade catalítica da caspase e, consequentemente, a inibição da caspase não afetará esta etapa.
- Trate com o estímulo escolhido aproximadamente 24 h após a transfecção e incube pelo tempo necessário para cada medicamento.
- Preparar o meio de imagiologia suplementar o meio de cultura do passo 1.1.2 com Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) e 2-mercaptoetanol (55 μM).
- Adicione a concentração desejada de estímulo ao meio de imagem pré-aquecido e misture suavemente.
- Remova o meio das células cuidadosamente com uma micropipeta p1000 e adicione 500 μL da solução de estímulo da etapa 5.1.2 na lateral do poço.
- Para executar poços de controle não tratados, adicione um meio de imagem sem o estímulo.
- Incubar as células em uma incubadora de cultura de tecidos umidificados (37 °C, 5% CO2) pelo tempo indicado para cada tratamento.
- Visualize as células usando um microscópio de epifluorescência ou confocal.
- Ligue o microscópio e a fonte de luz fluorescente, seguindo as instruções do fabricante.
- Selecione a objetiva de 10x ou 20x e coloque a placa de cultura no microscópio stage.
- Usando a ocular do microscópio, encontre células sob o filtro de 568 nm e concentre-se nas células que expressam o repórter dsRedmito/mCherry (glóbulos vermelhos).
- Conte todos os glóbulos vermelhos no campo visual e registre o número.
- Enquanto estiver no mesmo campo visual, mude para os filtros 488 ou 512 (GFP ou YFP), conte o número de glóbulos vermelhos que também são verdes (Vênus positivo ou BiFC positivo) e registre o número.
- Conte pelo menos 100 células dsRedmito/mCherry positivas a partir de um mínimo de três campos visuais individuais.
