Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação do experimento
- Fabricação do dispositivo de cultura de órgãos intestinais (3 dias)
- Usando uma impressora 3D, imprima os moldes de plástico reutilizáveis para o dispositivo de cultura de órgãos (o dispositivo possui 6 poços, com 24 orifícios pequenos e grandes, e para a tampa da tampa do dispositivo).
NOTA: Esses moldes de plástico podem ser usados para a fabricação de vários dispositivos.
- Insira as agulhas de ponta romba (22 G e 18 G) na posição apropriada dentro do molde do dispositivo e funda aproximadamente 20 g de mistura de polidimetilsiloxano (PDMS) (proporção de peso de 1:10, base para catalisador) para um conjunto do dispositivo e tampa.
- Coloque os moldes em uma câmara de vácuo por 30 min, para remover as bolhas de ar da mistura PDMS.
- Incube os moldes a 55 °C durante a noite, para completar a polimerização do PDMS.
- Quando o PDMS estiver definido, retire as agulhas do molde e solte cuidadosamente o dispositivo de cultura e a tampa dos moldes de plástico.
- Remova os resíduos de PDMS do contorno do poço usando uma lâmina cirúrgica. Fixe o dispositivo PDMS e a tampa do dispositivo em uma lamínula (microlâminas de 75 mm x 50 mm) usando adesivo de silicone não tóxico e deixe as peças endurecerem durante a noite (aplique a cola no lado liso do dispositivo).
- Insira doze agulhas de 22 G para o lúmen e doze agulhas de 18 G para o poço. Fixe todas as agulhas no lugar usando silicone e deixe descansar durante a noite. Insira duas agulhas de 18 G na tampa da tampa para um fluxo de ar adequado para dentro e para fora do dispositivo de cultura de órgãos intestinais.
- Verifique se há vazamentos em todas as agulhas usando uma seringa cheia de água. Verifique se não há vazamento dos poços enchendo os poços com água.
- Coloque dois nós cirúrgicos em cada agulha de 22 G que será conectada ao cólon. Coloque o dispositivo e a tampa em um saco de papel de autoclave e esterilize em uma autoclave.
- Meio de cultura (0,5 h)
- Em um capuz biológico, misture o seguinte (em um tubo de 50 mL): 37 mL de meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), 10 mL de reposição de soro KSR, 1 mL de suplemento de B27, 0,5 mL de suplemento de N2, 0,5 mL de tampão HEPES 1 M e 0,5 mL de aminoácidos não essenciais.
- Filtrar e conservar o meio completo a 4 °C.
- Preparação de tubos e ferramentas cirúrgicas
- Corte o comprimento apropriado dos tubos para o lúmen de entrada, poço de entrada, lúmen de saída e poço de saída (12 tubos curtos e 12 tubos longos). Conecte um adaptador apropriado a cada lado do tubo.
- Prepare as ferramentas cirúrgicas: tesoura reta, 4 pinças finas e 2 pinças afiadas.
- Coloque os tubos e as ferramentas cirúrgicas em um saco de papel de autoclave e esterilize-os usando uma autoclave.
- Prepare a entrada luminal (estimulação desejada - bactérias, fezes, medicamentos, etc.).
- Antes do experimento, determinar a carga bacteriana da cultura bacteriana, por diluições seriadas, e cultivar em condições aeróbias e/ou anaeróbias.
- Depois de calcular a carga bacteriana, diluir as culturas bacterianas em um meio de cultura de tecidos estéril para obter a concentração bacteriana necessária. Para amostras fecais, filtre usando um filtro de 100 μm.
nota: Para estimulação não bacteriana (drogas, metabólitos, etc.), dilua a substância até a concentração necessária usando o meio de cultura intestinal.
2. Preparação da configuração do experimento
- Dentro da incubadora de cultura de órgãos, ligue a unidade de aquecimento e ajuste-a para 37 °C.
- Configure as bombas, bem como as seringas de entrada e saída.
- Entrada do meio de cultura de tecidos
- Em uma capela de fluxo biológico ou laminar, encha as seringas do poço de entrada com um meio de cultura completo. O volume final depende da duração do experimento e da vazão; geralmente 1 mL / h mais um meio adicional para purga.
- Conecte os tubos às seringas usando o adaptador Luer-lock. Coloque as seringas cheias nas bombas de seringa.
- Purgue as seringas de entrada. Certifique-se de que o meio do poço flua de todos os tubos para um vidro residual.
- Entrada luminal
- Encha as seringas de entrada luminal com tratamento de estimulação (bactérias, medicamentos, etc.). O volume depende da duração do experimento e da taxa de fluxo (geralmente 30 μL / h mais um meio adicional para purga).
- Conecte os tubos às seringas usando o adaptador Luer-lock. Coloque as seringas cheias nas bombas de seringa.
- Purgue as seringas de entrada. Certifique-se de que a estimulação flui de todos os tubos para um copo usado. Tenha cuidado para não contaminar os diferentes estímulos.
- Saídas
- Coloque as seringas vazias nas bombas de seringa de saída (defina o modo de bomba para 'retirada').
- Configuração do dispositivo
- Defina o regulador que controla a vazão da mistura de gases (95% O2 + 5% CO2) para um fluxo suave e mínimo.
- Examine o dispositivo em uma coifa laminar.
- Lave as agulhas do dispositivo com IMDM estéril para lavar as agulhas.
- Adicione 500 μL de meio de cultura estéril em cada poço do dispositivo.
- Preparação para dissecção de tecidos
- Coloque as ferramentas cirúrgicas estéreis dentro da capa laminar.
- Encha uma seringa de 10 mL com IMDM estéril e conecte uma agulha estéril (autoclavada) de 22 G para lavagem do cólon.
3. Culturas de órgãos
- Sacrifício de camundongos e dissecção de tecidos
- Em um capuz laminar, sacrifique camundongos de 12 a 14 dias por decapitação. Pulverize os ratos com etanol 70% e coloque-os em um prato de plástico.
- Usando uma tesoura afiada e uma pinça, disseque o camundongo e retire o trato digestivo do estômago ao ânus, cortando toda a gordura e tecidos conjuntivos. Corte os dois pontos e coloque-o em um novo prato.
nota: Minimize o contato com o tecido do cólon. Não toque na parte média do tecido do cólon. Segure o tecido suavemente e apenas nas bordas do tecido.
- Lavagem e lavagem do cólon
- Sob um microscópio de dissecção, lave suavemente o conteúdo do cólon com IMDM estéril (no lado proximal) com a seringa preparada de 10 mL (etapa 2.7.2). Depois de remover as fezes do tecido intestinal, coloque o cólon em uma nova placa de 6 poços preenchida com 0,5 mL de IMDM estéril.
- Conectando os dois pontos ao dispositivo
- Pegue o lenço, conecte-o cuidadosamente à agulha 22 G e faça um laço apertado com os dois fios. Neste ponto, é imperativo manter a orientação correta do cólon para o fluxo do lúmen (proximal = entrada, distal = saída). Repita as etapas 3.2-3.3 para todos os 6 tecidos.
- Verifique se as travas Luer da agulha de entrada estão vazias do meio. Caso contrário, esvazie-os. Adicione estímulos à trava Luer da agulha de entrada (para evitar a entrada de bolhas de ar no lúmen). Repita esta etapa para cada cólon com a estimulação apropriada.
- Verifique se todos os lenços estão conectados e coloque a tampa da tampa em cima do dispositivo.
- Conectando o dispositivo de cultura de órgãos às bombas
- Coloque o dispositivo na câmara pré-aquecida com temperatura controlada (37 °C).
- Conecte o fluxo de gás
- Conecte o adaptador de gás à tampa da tampa usando a agulha de entrada apropriada.
- Conecte os tubos de entrada e saída ao dispositivo.
nota: Conecte o lado proximal do cólon às cubas de entrada.
- Purgue o lúmen com as entradas de estimulação.
- Flua suavemente a estimulação luminal através do intestino e verifique o fluxo do meio nos tubos de saída.
- Lave o meio externo.
- Lave o meio externo 3 vezes (ajuste as bombas a uma taxa de 600 μL/min para entrada e saída). Cada lavagem leva 1 minuto (começando por esvaziar o poço).
- Inicie o experimento.
- Inicie as bombas nas seguintes taxas:
Taxa de fluxo: lúmen: entrada - 30 μL / h, saída - 35 μL / h < br / >
Meio externo: entrada - 1000 μL / h, saída - 950 μL / h < / >
nota: O tempo de experimento pode variar entre 30 min a 24 h.
- Fim do experimento (até 24 h para culturas de órgãos do cólon)
- Desconecte todos os tubos do dispositivo.
- Desconecte os lenços das agulhas e continue com as leituras desejadas.
