Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Preparação WS-CM
- Gerar meio inteiro condicionado à fumaça (WS-CM) conforme descrito anteriormente.
- Prepare o WS-CM passando fumaça de quatro cigarros de referência 3R4F através do meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sem vermelho de fenol usando o seguinte regime de fumagem: 35-60-2, volume de sopro em ml, intervalo de sopro em segundos e duração do sopro em segundos, respectivamente. Cada preparação gera uma amostra de 20 ml.
- Rotule o(s) tubo(s) com data, hora de conclusão e nome e número do cigarro. Conservar as alíquotas de 500 μl a -80 °C imediatamente após a defumação.
- Analise alíquotas de WS-CM congelado para determinar os níveis de nicotina, nitrosaminas específicas do tabaco e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, conforme descrito anteriormente.
2. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico, PBMCs
- Colete sangue fresco de doadores saudáveis (que não são consumidores de produtos de tabaco) Isole PBMCs de sangue fresco conforme descrito abaixo.
- Antes da chegada da bolsa de sangue, tenha um frasco de 500 ml, tesoura, tampão de isolamento e solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) (RT) pronta em uma capa de cultura de células de nível de biossegurança 2 (BSL-2). O tampão de isolamento deve ser protegido da luz.
- Segure a bolsa de sangue de cabeça para baixo e corte o tubo logo abaixo de onde foi preso, deixando pelo menos 3 cm de tubo.
- Retire a tampa do frasco de 500 ml e segure o tubo por cima da abertura do frasco. Pegue a bolsa de sangue e inverta-a para permitir que o sangue flua livremente da bolsa para a garrafa até que a bolsa esteja vazia. Deixe o sangue fluir para a parede interna da garrafa em vez de direto para baixo para evitar a criação de bolhas.
- Despeje o tampão de isolamento na garrafa na proporção de 1:5 de tampão de isolamento para sangue. Tampe bem o frasco e inverta-o suavemente, de ponta a ponta, 10 vezes. Deixe o frasco na capa de cultura de células para incubar com as luzes apagadas, por 1 hora em RT.
- Uma camada clara cor de palha se acumulará acima do sangue. Remover esta camada com uma pipeta serológica de 25 ml para tubos cónicos de 50 ml. A quantidade coletada pode variar de 50 a 300 ml, dependendo do sujeito que doou sangue.
- Centrifugue os tubos a 200 x g por 10 min em RT.
- Aspire o sobrenadante translúcido, deixando o pellet cor de sangue escuro. O pellet ficará solto, mas viscoso.
- Pipetar 3 ml de tampão de isolamento para tubos cónicos de 15 ml.
- Ao pellet ressuspenso, adicionar 20 ml de DPBS por cada 50 ml de líquido cor de palha recolhido no passo 2.1.5. Vórtice para misturar completamente e consolidar o líquido ressuspenso de vários tubos. Este líquido contém células sanguíneas suspensas.
- Com uma pipeta de transferência, transfira 5 ml das células sanguíneas suspensas para 3 ml de tampão de isolamento na etapa 2.1.8. Inclinar lenta e suavemente o tubo cónico de 15 ml que contém a suspensão celular para criar duas camadas separadas. Centrifugue os tubos a 400 x g por 40 min em RT com aceleração mínima e sem freio.
- Utilizar uma pipeta de transferência para remover a camada intermédia turva resultante (buffy coat) contendo PBMCs para um tubo cónico de 50 ml. Evite desenhar outras camadas claras abaixo dela. Transferir não mais de 25 ml para cada tubo cónico de 50 ml.
- Adicione 25 ml de tampão de funcionamento a frio (ou mais para preencher todo o volume restante do tubo cónico de 50 ml) para lavar as células. Centrifugue as células a 400 x g durante 10 min a 4 °C.
- Ressuspenda o pellet com 10 ml de tampão. Isso contém PBMCs. Conte as células e use-as imediatamente ou coloque-as no gelo para congelar.
3. Congelamento e descongelamento dos PBMCs
- Centrifugue as células mononucleares do sangue erífero (PBMCs) que foram coletadas na etapa 2.1.13 por 10 min a 400 x g.
- Encha o recipiente de congelamento com álcool isopropílico de acordo com as instruções do fabricante.
cuidado: O álcool isopropílico é inflamável e agudamente tóxico.
- Ressuspenda o pellet com meio RPMI 1640 (4 °C) contendo 20% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Este é o meio de congelamento RPMI 1640. Ressuspenda o pellet com uma quantidade de meio de congelamento que resultará em uma suspensão com cerca de 5 x 107 células/ml. O número de células disponíveis para congelamento varia.
- Dispensar alíquotas de 1 ml de suspensão celular em criotubos de 2 ml e colocar os criotubos no recipiente de congelação. Coloque o recipiente de congelamento com criotubos em um freezer a -80 ° C para armazenar O / N e, em seguida, remova os criotubos e transfira para armazenar em um freezer criogênico entre -150 ° C e -190 ° C.
- Retirar o criotubo do armazenamento criogénico e descongelá-lo rapidamente em banho-maria a 37 °C.
- Transfira imediatamente os PBMCs descongelados no criotubo para um tubo cônico de 15 ml com 10 ml de meio completo RPMI 1640 (4 ° C) contendo 10% de FBS, 1% de caneta / estreptococos e 1% de L-glutamina. O conteúdo do criotubo descongelado deve ser transferido o mais rapidamente possível para obter a máxima viabilidade celular.
- Centrifugue os PBMCs a 400 x g por 10 min.
- Ressuspender o sedimento com 5 ml de meio completo RPMI 1640 e contar as células.
- Meça a viabilidade celular por métodos estabelecidos, como o método de exclusão de azul de tripano. Geralmente, a viabilidade celular com este método é de cerca de 90 a 95%. Os PBMCs agora estão prontos para uso em experimentos.
4. Coloração intracelular e citometria de fluxo
NOTA: As diluições listadas aqui são para o propósito deste estudo. As diluições podem ser ajustadas em conformidade.
- Diluir WS-CM em uma placa de 96 poços usando meio completo RPMI até um volume total de 100 μl / poço na concentração de 0,3, 1,56, 3 e 5 μg / ml de unidades de equi-nicotina.
- Na mesma placa, diluir a nicotina nas seguintes concentrações: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 e 4000 μg/ml.
cuidado: A nicotina é agudamente tóxica e perigosa para o meio ambiente.
- Adicionar 100 μl de PBMCs suspensos em meio RPMI completo a uma concentração de 1 × 106 células/alvéolo. O volume total de células mais WS-CM ou nicotina será de 200 μl/poço.
- Cubra a placa e incube por 3 horas a 37 ° C e 5% de CO2.
- Lave as células em RT centrifugando a 300 × g por 3 min, aspirando o sobrenadante, agitando o fundo da placa com a placa coberta e, finalmente, ressuspendendo as células com 200 μl de tampão de corrida gelada e repita a etapa de lavagem mais uma vez.
- Adicione 200 μl de meio RPMI completo à placa e repita a etapa de lavagem mais uma vez.
- Prepare as concentrações de trabalho de 2 μl/ml de GolgiPlug e 10 μg/ml de LPS usando meio completo RPMI e adicione 200 μl a cada poço.
- Incubar a placa durante 6 horas a 37 °C e 5% de CO2.
- No final da etapa 9.8, lave as células com tampão de corrida (4 °C) e gire a 300 x g por 3 min a 4 °C.
- Adicione 100 μl de Cytofix a cada alvéolo e incube durante 20 min a 4 °C.
- Lave as células 3 vezes conforme descrito na etapa 9.9 com 1x Permwash (4 °C) a 300 x g por 3 min a 4 °C.
- Adicione 45 μL de 1x Cytoperm a cada poço, seguido por 5 μl de cada um dos seguintes anticorpos a cada poço: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incubar a 4 °C durante 30 min.
- Lave as células duas vezes conforme descrito na etapa 9.9 com 1x Permwash (4 ° C) e uma vez com tampão de corrida (4 ° C) a 300 x g por 3 min a 4 ° C.
- Ressuspenda as células com 200 μl de paraformaldeído a 2% (4 °C). Transferir as células para tubos de 12 × 75 mm e analisar as amostras em um citômetro de fluxo.
cuidado: O paraformaldeído é corrosivo, agudamente tóxico e perigoso para a saúde.
