Síntese de biofilme in vitro por Staphylococcus aureus

1. Preparação de biofilme in vitro

1. Obtenha colônias isoladas de S. aureus de um estoque criopreservado usando uma técnica de placa de listras em uma placa de ágar rica em nutrientes, como o ágar de soja tríptica (consulte a Tabela de Materiais).
2. Cubra os alvéolos individuais de uma placa de 96 poços com 100 μL de poli-L-lisina (PLL) a 0,001% (v / v) diluída em H₂O estéril e incube em temperatura ambiente por 30 min. Assepicamente, aspire a solução de PLL usando um coletor de aspiração assistido por vácuo. Deixe os poços secarem durante a noite em temperatura ambiente.
   nota: Todas as etapas de aspiração no protocolo são realizadas usando uma armadilha de aspiração assistida por vácuo, salvo indicação em contrário.
3. Preparar uma cultura durante a noite inoculando uma colónia de S. aureus em meio essencial mínimo alfa (MEMα) suplementado com 2% de glicose e incubar a 37 °C, agitando a 200 rpm durante 16-18 h.
4. Diluir a cultura durante a noite transferindo 50 μL para 5 mL de MEMα fresco suplementado com glicose a 2% e incubar a 37 ° C, agitando a 200 rpm, até meados da fase logarítmica, geralmente entre densidade óptica 600 (OD_600nm) de 0,5-0,8. Use MEMα para normalizar a cultura logarítmica média para um OD_600nm de 0,1.
5. Transfira 150 μL de cultura normalizada para cada poço da placa de 96 poços tratada com PLL. Incubar estaticamente por 18-20 h em uma câmara umidificada a 37 °C.
   nota: Os biofilmes também podem ser cultivados em outros formatos, como lâminas de μ canais (ver Tabela de Materiais).
6. Aspirar o sobrenadante para remover as células planctónicas. Lave suavemente a biomassa restante com 150 μL de solução salina balanceada de Hanks (HBSS) para remover as células soltas. Adicione HBSS gota a gota para evitar interromper o biofilme.
   nota: Ao aspirar o sobrenadante e o HBSS durante as lavagens, deixe líquido suficiente (sobrenadante ou HBSS) nos poços contendo biofilme, de modo que o biofilme ainda esteja imerso. Isso evita a ruptura da estrutura do biofilme quando o HBSS é adicionado gota a gota para lavar o biofilme.
7. Repita a etapa 1.6 pelo menos mais duas vezes para remover todas as células planctônicas. Neste ponto, os biofilmes estão prontos para experimentos imediatos a jusante.
   nota: Se os biofilmes não forem usados para experimentos com neutrófilos, o HBSS pode ser substituído por solução salina tamponada com fosfato (PBS). O HBSS é preferível ao PBS, pois o HBSS contém componentes, incluindo glicose, que fornecem condições ideais para a ativação de neutrófilos.