1. Preparação antigénica
NOTA: Três preparações antigênicas diferentes podem ser usadas para avaliar a resposta imune ao Hi. Estes são 1) um componente subcelular (normalmente da parede celular bacteriana); 2) bactérias mortas e inativadas; e 3) bactérias vivas. Determinar a utilização de cada preparação antigénica antes do início de quaisquer experiências.
- Componentes subcelulares
- Obter componentes subcelulares de fontes, incluindo preparações comerciais, componentes desenvolvidos internamente e/ou de outros investigadores.
nota: Componentes subcelulares, geralmente da parede celular bacteriana, podem ser usados e incluem proteínas da membrana externa, como P6 e lipooligossacarídeo (LOS). Esses componentes subcelulares são geralmente derivados em centros especializados. A descrição de como eles são feitos está além do escopo deste artigo. Recomenda-se o contato direto com especialistas neste campo para obter esses componentes.
- Bactérias mortas/inativadas
- Obtenha a bactéria da amostra apropriada (por exemplo, escarro ou broncoscopia). Confirme a cepa como H. influenzae usando um laboratório de microbiologia apropriado. Realize a tipagem das amostras de H. influenzae para confirmar que não são tipificáveis (NTHi, por um laboratório especializado em microbiologia).
- Para obter um antígeno representativo, use várias cepas NTHi (pelo menos 5, cada uma com aproximadamente a mesma quantidade) para produzir um antígeno combinado. Armazenar as cepas a -70 °C em caldo de glicerol em tubos de microcentrífuga.
nota: Neste experimento, dez linhagens distintas foram utilizadas.
- Descongelar as estirpes (um tubo de microcentrífuga de cada vez) para placas de ágar chocolate e crescer durante a noite numa incubadora a 37 °C com 5% de CO2. Adicione as bactérias a 500 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e lave-as duas vezes (gire a 300 x g por 5 min). Use um padrão MacFarland ou um espectrofotômetro para alíquota NTHi a uma concentração de 108 mL (usando um recipiente de 5 mL ou equivalente).
- Inative as bactérias por calor, colocando-as em banho-maria a uma temperatura de 56 °C por 10 min.
- Sonicar as bactérias usando uma configuração de sonicação contínua em uma velocidade de baixa a média por 30 segundos.
- Alíquota do volume adequado de amostras em tubos de microcentrífuga. Para uma amostra de 10a 8 ml, utilizar alíquotas de 50 μL (ou seja, 20 amostras por ml) e congelá-las a -70 °C até serem necessárias.
- Bactérias vivas
- Primeiro, caracterize as bactérias vivas conforme mencionado na etapa 1.2.1. Use uma cepa bem caracterizada. Certifique-se de que a cepa também seja armazenada em caldo de glicerol a -70 °C como reserva.
- Cultive as bactérias em meios enriquecidos, como pratos de ágar chocolate ou em caldo.
- Para usar placas de ágar chocolate, espalhe as bactérias por no mínimo a cada 3-4 dias com espalhadores estéreis.
- Como alternativa, use caldo de infusão cerebral e cardíaca (BHI) enriquecido com os fatores X (hemina) e V (dinucleotídeo β-nicotinamida adenina) para cultivar as bactérias. Inocular NTHi de placas noturnas em 5-10 mL de caldo BHI suplementado com hemina e dinucleotídeo de adenina β-nicotinamida (ambos 10 μg/mL) e cultura durante a noite a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5%
nota: Isso tem a vantagem de reprodutibilidade, maior contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) e todas as bactérias em uma fase semelhante de crescimento logarítmico (em placas, a viabilidade bacteriana pode ser maior dependendo da posição na cultura).
- Use uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100 bactérias em uma célula para provocar uma forte resposta imune, mantendo a viabilidade celular. Use o padrão MacFarland ou espectrofotômetro para avaliar o número de bactérias.
- Certifique-se de que o meio usado para ensaios de NTHi ao vivo esteja livre de qualquer soro humano, pois isso matará as bactérias. Amostras de soro animal (por exemplo, soro fetal de bezerro) geralmente não causam problemas.
nota: Use os métodos descritos abaixo para analisar amostras de tecido padrão, como sangue periférico, amostras de broncoscopia (particularmente lavagem broncoalveolar (LBA)) e tecido pulmonar ressecado. Incubar as amostras com o antígeno Hi de 10 min a 24 h ou mais.
2. Avaliação da função linfocitária no sangue periférico
- Use preparações de sangue total ou células mononucleares para ensaios de citometria de fluxo.
- Adquira amostras de cada sujeito por punção venosa. Colete 4 mL de sangue de uma veia periférica em um tubo de heparina de lítio e divida as amostras em alíquotas para controle e estimulação do antígeno.
- Adicione anticorpos coestimulatórios (anti-CD28 e CD49d, 1 μL / mL) a ambas as amostras. Adicionar NTHi à amostra de antigénio e incubar a 37 °C e 5% de CO2 durante 1 h. Para a preparação de NTHi morta, adicione 200 μL do antígeno a 2 mL de sangue. Para NTHi vivo, adicione células NTHi vivas em um MOI de 100:1 aos glóbulos brancos (conforme medido pelo hemocitômetro).
- Adicione o agente bloqueador de Golgi Brefeldin A (10 μL/mL) às amostras e incube-as por mais 5 h.
nota: O bloqueio do aparelho de Golgi impede que as citocinas sejam exportadas para fora da célula.
- Se for usado sangue total, lise os eritrócitos com cloreto de amônio a 0,8% para deixar apenas leucócitos em solução. Fixe os leucócitos usando 500 μL de paraformaldeído a 1% -2% por 1 h.
- Conte as células por hemocitômetro, permeabilize 106 células com 100 μL de saponina a 0,1% por 15 min e incube as células com anticorpos marcados com fluorescência. Lave as células e analise-as usando um citômetro de fluxo.
nota: A quantidade de anticorpos marcados com fluorescência será específica para cada citocina. Siga as instruções do fabricante. Normalmente, 106 células em 100 μL de solução serão coradas por 1 h. A maioria dos anticorpos obtidos comercialmente será suficiente para realizar 25-100 testes.
- Determine a proporção de células que respondem ao antígeno bloqueando a população de linfócitos relevante (as células são bloqueadas por CD45, depois por CD3 e, posteriormente, pela expressão de CD4 ou CD8), conforme mostrado na Figura 1. Realize coloração de fundo em células não estimuladas para todas as citocinas a serem analisadas. Rastreie 100.000 células para analisar cada citocina para células estimuladas e controle.
