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Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Preparação antigénica
- Bactérias vivas
- Primeiro, caracterize as bactérias vivas. Obtenha a bactéria da amostra apropriada (por exemplo, escarro ou broncoscopia). Confirmar a estirpe como Haemophilus influenzae utilizando um laboratório de microbiologia adequado. Realize a tipagem das amostras de H. influenzae para confirmar que não podem ser digitadas (por um laboratório especializado em microbiologia). Use uma cepa bem caracterizada. Certifique-se de que a cepa também seja armazenada em caldo de glicerol a -70 °C como reserva.
- Cultive as bactérias em meios enriquecidos, como pratos de ágar chocolate ou em caldo.
- Para usar placas de ágar chocolate, espalhe as bactérias por no mínimo a cada 3-4 dias com espalhadores estéreis.
- Como alternativa, use caldo de infusão cerebral e cardíaca (BHI) enriquecido com os fatores X (hemina) e V (dinucleotídeo β-nicotinamida adenina) para cultivar as bactérias. Inocular H. influenzae não tipável (NTHi) de placas noturnas em 5-10 mL de caldo BHI suplementado com hemina e dinucleotídeo de adenina β-nicotinamida (ambos 10 μg/mL) e cultivar durante a noite a 37 °C em uma incubadora de CO2 com 5% de dióxido de carbono.
nota: Isso tem a vantagem de reprodutibilidade, maior contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) e todas as bactérias em uma fase semelhante de crescimento logarítmico (em placas, a viabilidade bacteriana pode ser maior dependendo da posição na cultura).
- Use uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100 bactérias em uma célula para provocar uma forte resposta imune, mantendo a viabilidade celular. Use o padrão MacFarland ou espectrofotômetro para avaliar o número de bactérias.
- Certifique-se de que o meio usado para ensaios de NTHi ao vivo esteja livre de qualquer soro humano, pois isso matará as bactérias. Amostras de soro animal (por exemplo, soro fetal de bezerro) geralmente não causam problemas.
NOTA: Use os métodos descritos abaixo para analisar amostras de tecido padrão, como sangue periférico, amostras de broncoscopia (particularmente lavagem broncoalveolar (LBA)) e tecido pulmonar ressecado. Incubar as amostras com o antígeno Hi de 10 min a 24 h ou mais.
2. Avaliação da função linfocitária/mediadores inflamatórios no tecido pulmonar
- Geralmente não é possível obter linfócitos suficientes a partir da broncoscopia; portanto, use o tecido pulmonar a partir de amostras de lobectomia. A otimização de amostras de tecido pulmonar requer estreita ligação com o serviço de anatomia patológica. Certifique-se de que o tecido tenha uma margem de pelo menos 3 cm do tumor e seja o tecido celular sem enfisema significativo (conforme determinado pelo patologista).
- Quebre o tecido pulmonar em uma suspensão celular antes que ele possa ser usado para ensaios de citometria de fluxo. Digerir quimicamente o tecido pulmonar (por exemplo, com colagenase) ou desagregá-lo mecanicamente.
nota: A desagregação mecânica do tecido pode ser preferida, pois está associada a uma melhor coloração superficial das células (por exemplo, marcação CD3/4).
- Obtenha amostras de lobectomia de um patologista (geralmente obtidas de pacientes em tratamento de câncer de pulmão). Corte cerca de 20-40 g da amostra em3-5 mm 3 seções. Coloque-os dentro de uma câmara estéril de 50 μL antes de serem fragmentados mecanicamente usando um desagregador apropriado.
- Após a desagregação tecidual, lise os eritrócitos com 10:1 (ou seja, 5 mL) de cloreto de amônio a 0,8% (cloreto de amônio 150 mM (NH4Cl), bicarbonato de sódio 1 mM (NaHCO3) e solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,1 mM.
nota: Alternativamente, um sistema automatizado como o Q-prep pode ser usado.
- Ressuspenda as células em RPMI estéril (o volume dependerá do número de células e geralmente é de 10-20 mL) e, em seguida, filtre-as através de uma malha de náilon estéril de 100 μm. Conte o número de células viáveis usando o método de exclusão de azul de tripano.
3. Ensaio de infecção por NTHi
- Ressuspenda as células pulmonares até uma concentração celular final de 4 x 106 células/mL por tubo (amostras de controle e estimuladas).
- Use uma suspensão de 4 x 106-6 x 106 células em 1 mL de RPMI para o tubo de controle (negativo). Utilizar a mesma quantidade para o tubo NTHi (qualquer amostra adicional pode ser utilizada como controlo positivo com o superantigénio estafilocócico E (SEB). Infecte as células no tubo NTHi em um MOI de 100 bactérias por célula. Afrouxe a tampa meia rotação para permitir a transferência de gás nos tubos.
- Colocar as células num rotador de tubos e incubá-las a 37 °C enquanto rodam a 12 rpm.
- Para evitar a exportação extracelular de citocinas, adicione um bloqueador de Golgi (Brefeldin A) às suspensões celulares 1 h após a estimulação até uma concentração final de 10 μg / mL. Retorne as suspensões celulares por mais 16-22 h de incubação em rotação.
- Lave a suspensão celular com 500 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,01% de azida sódica, NaN3.
- Adicione os anticorpos para coloração intracelular de citocinas (a escolha dos anticorpos deve ser determinada pelo investigador). Coce a suspensão celular para marcadores específicos da superfície celular de linfócitos humanos (por exemplo, CD45, CD3, etc.) por 1 h. Lave as células com PBS, fixe-as e permeabilize-as.
- Fixe as células usando 500 μL de paraformaldeído a 1% -2% por 1 h.
- Conte as células por hemocitômetro, permeabilize 106 células com 100 μL de saponina a 0,1% por 15 min e incube as células com anticorpos marcados com fluorescência. Lave as células e analise-as usando um citômetro de fluxo.
nota: A quantidade de anticorpos marcados com fluorescência será específica para cada citocina. Siga as instruções do fabricante. Normalmente, 106 células em 100 μL de solução serão coradas por 1 h. A maioria dos anticorpos obtidos comercialmente será suficiente para realizar 25-100 testes.
- Incube as células com anticorpos intracelulares de coloração de citocinas (por exemplo, interferon-gama, IFN-γ e fator de necrose tumoral beta, TNF-α ou interleucina, IL-13 e IL-17A) por 1 h.
nota: Recomenda-se corar primeiro os marcadores de superfície e, em seguida, intracelular, pois a fixação pode causar alterações conformacionais nas proteínas de superfície às quais os anticorpos se ligam.
- Lave as células com 500 μL de PBS e ressuspenda em 100 μL de PBS antes da aquisição de dados em um citômetro de fluxo.