Determinação da produção de ROS por neutrófilos após interação com biofilme opsonizado

Resumo

Fonte: Rana, P. S. J. B., et al. Ensaios In vitro Padronizados para Visualizar e Quantificar Interações entre Neutrófilos Humanos e Biofilmes de Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2022)

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de quimioluminescência in vitro para detectar a geração de espécies reativas de oxigênio por neutrófilos após a exposição a um biofilme bacteriano opsonizado.

Protocolo

1. Medição de ROS produzidas por neutrófilos

1. Adicione 100 μL de soro humano normal a 20% (diluído em HBSS) gota a gota ao biofilme lavado e incube a 37 ° C sob condições estáticas por 30 min para opsonizar o biofilme.
2. Aspire a solução de soro a 20% e lave os biofilmes gota a gota com 150 μL de HBSS uma vez. Aspirar o HBSS, deixando para trás poços com biofilmes opsonizados.
   nota: Para a interpretação do experimento, recomenda-se um mínimo de quatro grupos: (A) Neutrófilos + Biofilme, (B) Neutrófilos + PMA (controle positivo, consulte a Tabela de Materiais), (C) Neutrófilos apenas e (D) Biofilme apenas.
3. Adicionar luminol (ver Tabela de Materiais) aos neutrófilos ressuspensos em HBSS a uma concentração de 4 x 10⁶ células/mL de modo que a concentração final de luminol seja de 50 μM. Esta solução está pronta para uso nos grupos (A) e (C). Adicione 4 x 10⁵ neutrófilos misturados com luminol aos poços com biofilmes opsonizados.
4. Em um tubo separado, prepare a solução de luminol 50 μM em HBSS sem neutrófilos e adicione-a ao poço contendo biofilme (grupo D).
5. Alíquota de 350 μL de neutrófilos misturados com luminol e adicionar forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a uma concentração final de 500 ng/mL à mistura. Para o grupo (B), adicione 4 x 10⁵ neutrófilos desta mistura em poços sem biofilme. Isso serve como um controle positivo.
   nota: A concentração de PMA indicada nesta etapa é relativamente alta para garantir uma resposta robusta à explosão, pois os neutrófilos estimulados por PMA são um controle positivo. O PMA pode ser usado em uma concentração mais baixa para ativar neutrófilos, dependendo do experimento.
6. Centrifugar a placa a 270 x g durante 30 s a 4 °C.
7. Certifique-se de que o leitor de placas esteja ajustado para 37 °C junto com a configuração de luminescência e leitura cinética por 60 min com intervalos de 3 min. Coloque a placa no leitor de placas para medir a produção de ROS por neutrófilos por 60 min.
   nota: Para este ensaio, os biofilmes foram cultivados em placas brancas usadas para ensaios de luminescência. O PMA é um agonista conhecido para a resposta de explosão oxidativa. Ao realizar estudos envolvendo PMA, certifique-se de que o PMA seja adicionado na etapa final enquanto a solução contendo neutrófilos estiver fria, pois o PMA inicia imediatamente a resposta de explosão.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de centrífuga cônicos de 50 mL	Thermo Científico	339652
Cotonete com álcool	Bd		Usado para coleta de sangue
Contador de células	Bal Fornecimento	202C
Placas de poliestireno de fundo plano de 96 poços transparentes	Costar	3370
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) 1x	Gibco	14190-144
Solução salina balanceada de Hanks (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-CV	Sem vermelho de cálcio, magnésio e fenol
Hemocitômetro	Linha brilhante
Luminol	sigma	A8511-5G
Mídia essencial mínima (MEM) Alpha 1x	Gibco	Rolamento 41061-029
Soro humano normal	Tecnologia Complemento	Nhs
Placa de Petri (100 x 15 mm)	VWR	Rolamento 25384-342
Acetato de forbol 12-miristato 13
Solução de poli-L-lisina	sigma	Pág. 4707-50ML
Software SoftMax Pro	Dispositivos Moleculares		Software leitor de microplacas usado para aquisição de dados
SpectraMax i3x	Dispositivos Moleculares		Leitor de microplacas