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1. Preparação de biofilme in vitro
- Obtenha colônias isoladas de S. aureus de um estoque criopreservado usando uma técnica de placa de listras em uma placa de ágar rica em nutrientes, como o ágar de soja tríptica (consulte a Tabela de Materiais).
- Cubra os alvéolos individuais de uma placa de 96 poços com 100 μL de poli-L-lisina (PLL) a 0,001% (v / v) diluída em H2O estéril e incube em temperatura ambiente por 30 min. Assepicamente, aspire a solução de PLL usando um coletor de aspiração assistido por vácuo. Deixe os poços secarem durante a noite em temperatura ambiente.
nota: Todas as etapas de aspiração no protocolo são realizadas usando uma armadilha de aspiração assistida por vácuo, salvo indicação em contrário.
- Preparar uma cultura durante a noite inoculando uma colónia de S. aureus em meio essencial mínimo alfa (MEMα) suplementado com 2% de glicose e incubar a 37 °C, agitando a 200 rpm durante 16-18 h.
- Diluir a cultura durante a noite transferindo 50 μL para 5 mL de MEMα fresco suplementado com glicose a 2% e incubar a 37 ° C, agitando a 200 rpm, até meados da fase logarítmica, geralmente entre densidade óptica 600 (OD600nm) de 0,5-0,8. Use MEMα para normalizar a cultura logarítmica média para um OD600nm de 0,1.
- Transfira 150 μL de cultura normalizada para cada poço da placa de 96 poços tratada com PLL. Incubar estaticamente por 18-20 h em uma câmara umidificada a 37 °C.
nota: Os biofilmes também podem ser cultivados em outros formatos, como lâminas de μ canais (ver Tabela de Materiais).
- Aspirar o sobrenadante para remover as células planctónicas. Lave suavemente a biomassa restante com 150 μL de solução salina balanceada de Hanks (HBSS) para remover as células soltas. Adicione HBSS gota a gota para evitar interromper o biofilme.
nota: Ao aspirar o sobrenadante e o HBSS durante as lavagens, deixe líquido suficiente (sobrenadante ou HBSS) nos poços contendo biofilme, de modo que o biofilme ainda esteja imerso. Isso evita a ruptura da estrutura do biofilme quando o HBSS é adicionado gota a gota para lavar o biofilme.
- Repita a etapa 1.6 pelo menos mais duas vezes para remover todas as células planctônicas. Neste ponto, os biofilmes estão prontos para experimentos imediatos a jusante.
nota: Se os biofilmes não forem usados para experimentos com neutrófilos, o HBSS pode ser substituído por solução salina tamponada com fosfato (PBS). O HBSS é preferível ao PBS, pois o HBSS contém componentes, incluindo glicose, que fornecem condições ideais para a ativação de neutrófilos.
2. Isolamento de neutrófilos
NOTA: Os neutrófilos foram isolados seguindo um método publicado anteriormente com pequenas alterações. Este protocolo de isolamento combina primeiro a centrifugação do gradiente de densidade, seguida pela sedimentação de dextrano a 3%. Esta seção cobre apenas o protocolo geral de isolamento de neutrófilos, concentrando-se nas alterações feitas no protocolo publicado. Além disso, o protocolo descrito abaixo é um dos muitos métodos que podem isolar neutrófilos e podem ser substituídos conforme necessário. Outros métodos para isolar neutrófilos incluem o uso de meios de separação celular ou separação celular de anticorpos magnéticos.
- Colete sangue de um doador adulto por punção venosa, de acordo com o protocolo descrito no IRB institucional. Antes da coleta de sangue, certifique-se de que a seringa tenha heparina livre de conservantes suficiente, de modo que a concentração final de heparina seja de 20 U/mL.
- Dilua o sangue heparinizado com 3/4 do volume de NaCl 0,9% livre de endotoxinas (ver Tabela de Materiais) em H2O à temperatura ambiente.
- Para cada 20 mL da amostra de sangue diluída, alíquota de 14 mL de um meio de gradiente de densidade disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) em um tubo cônico novo de 50 mL. Coloque cuidadosamente a amostra de sangue diluída sobre o meio de gradiente de densidade.
- Centrifugue a amostra de sangue em camadas a 400 x g por 40 min à temperatura ambiente. Certifique-se de que a centrífuga tenha uma quebra lenta para evitar perturbar a camada assim que a centrifugação for concluída.
nota: A amostra de sangue terá cinco camadas contendo uma mistura de solução salina e plasma, uma camada de células mononucleares, um meio de gradiente de densidade, neutrófilos e eritrócitos.
- Usando uma pipeta sorológica, aspire todas as camadas acima dos neutrófilos e do pellet eritrocitário, seguido por uma ressuspensão suave do pellet em NaCl a 0,9% sem endotoxina fria em H2O. Para cada pellet gerado a partir de uma amostra de sangue de 20 mL, ressuspenda o pellet de volta ao volume total de 20 mL. Adicione um volume de 1:1 de 3% de dextrano (consulte a Tabela de Materiais). Incube o tubo na vertical por 18-20 min no gelo.
nota: Certifique-se de que o dextrano a 3% seja feito com NaCl a 0,9% sem endotoxinas em H2O.
- Remova 20 mL da camada superior que contém neutrófilos e alguns eritrócitos em um novo tubo cônico de 50 mL e centrifugue-o a 355 x g por 10 min a 4 ° C. Despeje o sobrenadante deixando para trás um pellet vermelho.
- Ressuspenda suavemente o pellet em 10 mL de H2O frio e estéril por 30 segundos para lisar os eritrócitos restantes. Adicione imediatamente 10 mL de solução salina a 0,9% sem endotoxina fria à mistura para restaurar a tonicidade. Centrifugar a solução a 233 x g durante 3 min a 4 °C.
- Despeje o sobrenadante e ressuspenda o pellet contendo 95%-97% de neutrófilos em 1 mL de HBSS frio por 20 mL de amostra de sangue.
- Transfira 10 μL dos neutrófilos ressuspensos em 90 μL de corante de exclusão azul de tripano a 0,4% e conte as células usando um hemocitômetro (ver Tabela de Materiais).
nota: As células não viáveis são coradas de azul, pois o corante de exclusão do azul de tripano é impermeável nas células viáveis. Este protocolo fornece >99% de viabilidade celular.
- Adicionar HBSS adicional de modo que a concentração final de neutrófilos seja 4 x 106 células/mL.
nota: Para casos com viabilidade celular de <99%, a concentração final de 4 x 106 células/mL ainda pode ser alcançada; no entanto, o volume total de solução contendo 4 x 106 células/mL obtido diminuirá. A concentração final de neutrófilos pode ser ajustada de acordo com as necessidades experimentais do usuário. Os neutrófilos foram ressuspensos em uma concentração final de 4 x 106 células/mL para todos os experimentos descritos abaixo. Para levar em conta a variabilidade de doador para doador, é altamente recomendável que todos os experimentos envolvidos com neutrófilos sejam realizados com pelo menos três doadores diferentes.
3. Interações biofilme-neutrófilos de imagem
- Configure um biofilme usando as etapas 1.2 a 1.6. Para facilitar a imagem de biofilme, empregue uma cepa fluorescente de S. aureus, como a proteína fluorescente verde (GFP) que expressa USA300, para aumentar a facilidade da imagem de microscopia.
nota: Uma lâmina de 6 canais de μ (ver Tabela de Materiais) foi usada em vez de uma placa de 96 poços para demonstrar o modelo de biofilme in vitro (etapa 1).
- Incubar 4 x 106 células/mL de neutrófilos com 100 μM de corante Blue CMAC (7-amino-4-clorometilcumarina) (BCD, ver Tabela de Materiais) por 30 min em um balancim a 37 °C e 5% de CO2. Certifique-se de que as amostras sejam incubadas no escuro e limite a exposição à luz nas etapas restantes.
- Para lavar o excesso de BCD, centrifugue neutrófilos a 270 x g por 5 min e aspire o sobrenadante. Ressuspenda os neutrófilos em HBSS fresco. Neste ponto, adicione homodímero de etídio-1 (consulte a Tabela de Materiais) aos neutrófilos corados com BCD a uma concentração final de 4 μM para monitorar a morte de neutrófilos e bactérias.
- Adicione 150 μL de neutrófilos ao biofilme de S. aureus que foi cultivado em lâminas de μ, de modo que a proporção de neutrófilos para bactérias seja de 1:30 (neutrófilo: bactérias). Incube as lâminas μ em uma câmara umidificada por 30 min. O número de células bacterianas é baseado nas contagens de células obtidas a partir do plaqueamento de um biofilme de 18 h.
- Imagem da interação neutrófilo-biofilme usando canais fluorescentes correspondentes aos comprimentos de onda de excitação e emissão dos corantes/proteínas fluorescentes.
nota: Para o presente estudo, o BCD é 353/466 nm, o homodímero de etídio-1 é 528/617 nm e o GFP é 395/509 nm. Limite a exposição da amostra ao laser ou à luz para evitar o fotobranqueamento das amostras.
- Analise as imagens usando software de análise de imagens de microscopia ou programas como FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ e BAIT, entre muitos outros.
nota: Ao trabalhar com manchas, é importante considerar a especificidade dos corantes em uso. Algumas colorações funcionam em células procarióticas e eucarióticas, enquanto outras funcionam apenas em uma. Se neutrófilos e biofilmes forem corados separadamente usando corantes que possam corar ambos os tipos de células, certifique-se de lavar qualquer corante restante antes de combinar neutrófilos e biofilmes para evitar manchas cruzadas.