Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de Camundongos e DSS
- Mantenha os camundongos knockout (α-gustducina-/-) e os camundongos C57BL/6 de controle do tipo selvagem (α-gustducina+/+) pareados por idade, sexo e peso corporal individualmente em gaiolas limpas.
nota: Os camundongos knockout foram retrocruzados com camundongos C57BL / 6 por mais de 20 gerações e têm um fundo genético quase 100% C57BL / 6.
- Dissolva 30 g de pó de sulfato de dextrano sódico (DSS) em 1 L de água autoclavada. Misture até que a solução fique clara para garantir que a concentração final de trabalho seja de 3% (p / v).
nota: A solução DSS pode ser conservada à temperatura ambiente até 1 semana ou a 4 °C até à utilização.
2. Indução e avaliação da colite DSS em camundongos
- Pese e registre o peso corporal inicial de cada camundongo. Coloque os ratos individualmente em gaiolas de plástico padrão e etiquete as gaiolas.
- Substitua a água potável regular por uma solução de DSS a 3% por um total de 7 dias, aos quais ambos os grupos de camundongos tenham acesso ad libitum.
- Meça o peso corporal do camundongo, registre o consumo da solução DSS e colete e examine as fezes de cada camundongo diariamente durante a administração do DSS. Observe a gravidade da diarreia e do sangramento retal e converta-a no índice de doença induzido por DSS.
- Durante o experimento, calcula-se o percentual de perda de peso em relação ao peso inicial e o índice da doença para avaliar os sintomas da colite.
nota: O índice da doença é pontuado pela combinação de observações de diarreia e sangramento retal e é definido da seguinte forma: 0 (fezes normais, sem sangue), 1 (fezes moles, sem sangue), 2 (fezes moles, pouco sangue), 3 (fezes muito moles, sangramento modesto) e 4 (fezes aquosas, sangramento significativo). O índice da doença é analisado diariamente para cada camundongo.
- Ao final do tratamento DSS de 7 dias, sacrifique os camundongos por luxação cervical e prossiga com os experimentos restantes.
3. Preparação de Amostras de Tecido
- Coloque o camundongo em decúbito dorsal e limpe a pele do abdômen com etanol a 70%. Faça uma incisão na linha média de 3 cm de comprimento no abdômen com uma tesoura pequena para expor a cavidade abdominal.
- Use um par de pinças para separar cuidadosamente o baço de outros tecidos, remova o baço e meça seu tamanho.
- Identifique e levante o cólon com uma pinça e separe-o do mesentério circundante. Puxe todo o cólon até que o ceco e o reto estejam visíveis.
- Isole o cólon cortando-o na margem colonocecal e profundamente na pelve para liberar o cólon proximal e distal, respectivamente. Em seguida, meça e registre o comprimento do cólon isolado. Tenha cuidado para não danificar o tecido colônico durante o procedimento de dissecação.
- Lave o cólon com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada com uma seringa de 10 mL equipada com uma agulha de gavagem para remover as fezes e o sangue até que o eluído esteja completamente limpo.
- Para identificação histológica, divida as amostras de tecido igualmente em três partes: proximal, média e distal. Em seguida, fixe o tecido com paraformaldeído (PFA) a 4% durante a noite a 4 °C.
- Para a análise da expressão de citocinas, congele todo o cólon rapidamente com nitrogênio líquido e armazene-o a -80 °C até o uso.
4. Avaliação histológica da gravidade da colite induzida por DSS
- Imuno-histoquímica
- Após a fixação, mergulhe o tecido em uma solução de sacarose a 30% em 1x PBS durante a noite em um tubo de 15 mL para crioproteger as amostras.
- Incorpore o tecido em um composto de temperatura de corte ideal (OCT) e coloque-o a -20 °C até que o OCT endureça.
- Transferir o bloco OCT contendo o tecido para um criostato, ajustar o botão de espessura no criostato para 12 μm e cortar e recolher secções congeladas de 12 μm de espessura.
- Aquecer as secções de tecido recolhidas de um criostato a 65 °C durante 20 min numa placa quente. Lave as seções em 1x PBS 3 vezes, por 10 min cada. Incube as seções de tecido em peróxido de hidrogênio a 3% por 10 min para eliminar a peroxidase endógena. Lave as seções mais 3 vezes. Bloqueie os tecidos com tampão de bloqueio (3% de albumina de soro bovino (BSA), 0,3% de detergente não iônico, 2% de soro de cabra, 0,1% de azida de sódio em 1x PBS) em temperatura ambiente por 1 h ou mais.
- Substitua o tampão de bloqueio por uma solução contendo os seguintes anticorpos primários específicos do tipo de célula imune: CD45 para leucócitos, CD3 para células T, B220 para células B, CD11b para macrófagos e Ly6G para neutrófilos. Incubar a 4 °C durante a noite.
- Remova os anticorpos primários das seções de tecido por aspiração. Lave as seções com 1x PBS 3 vezes, por 10 min cada. Incubar as secções com anticorpo secundário biotinilado, seguido de incubação com o complexo estreptavidina-HRP à temperatura ambiente.
- Incube as seções com solução de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) para desenvolver uma cor marrom clara ou escura e visualize as células imunorreativas.
- Contra-corar as seções com hematoxilina e amônia diluída a 0,3% (v/v). Tire imagens de campo claro com ampliação de 10X sob um microscópio.
- Use um programa de processamento de imagem para identificar e quantificar a população das células imunes marcadas no epitélio e na lâmina própria (abaixo do epitélio) definindo 2 máscaras: use a primeira máscara no recurso baseado em cubo de cores para definir um limite de detecção de cores e medir as áreas reativas ao DAB coloridas; use a segunda máscara para determinar as áreas totais do epitélio e da lâmina própria na seção examinada. Expresse a população de células imunorreativas como uma razão entre a área de coloração das células infiltradas e a área total do tecido examinado.
