Matando células K562 por células mononucleares do sangue periférico expostas a preparações de produtos de tabaco

Resumo

Fonte: Arimilli, S. et al., Métodos para avaliar a citotoxicidade e imunossupressão de preparações de produtos de tabaco combustíveis. J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, estudamos o efeito de um meio totalmente condicionado à fumaça, uma preparação de produto de tabaco combustível, na morte de células K562 por células mononucleares efetoras do sangue periférico

.

Protocolo

1. K562 Ensaio de Morte

NOTA: As células K562 devem ser cultivadas em cultura a 37 °C e 5% de CO₂ com meio completo de RPMI até atingirem 80% de confluência antes do ensaio.

1. Prepare uma solução estoque de éster succinimidílico carboxifluoresceína (CFSE) a 5 mM adicionando 18 μl de DMSO ao frasco para injetáveis.
2. Diluir WS-CM ou nicotina em uma placa de 96 poços usando meio completo RPMI até um volume total de 100 μl/poço para atingir as unidades de equinicotina desejadas ou concentrações de nicotina para cada poço.
   cuidado: A nicotina é agudamente tóxica e perigosa para o meio ambiente.
3. Adicione 100 μl de PBMCs ao meio completo de RPMI a uma concentração de 1,5 x 10⁶ células/poço. O volume total de células com WS-CM ou nicotina será de 200 μl/poço.
4. Cubra a placa e incube por 3 horas a 37 ° C e 5% de CO₂.
5. Lave as células K562 adicionando 10 ml de DPBS e centrifugue a 400 x g por 8 min em RT.
6. Ressuspenda as células com 10 ml de DPBS e conte as células K562.
7. Prepare uma solução de trabalho CFSE adicionando 1 μl de solução estoque CFSE a 1 ml de DPBS.
8. Adicionar 1 ml da solução de trabalho CFSE a 1 ml da suspensão de células K562 contendo 1 - 2 x 10⁷ células. Vórtice e incubar precisamente por 2 min em RT.
9. Adicione imediatamente 200 μl de FBS. Vórtice e incubar precisamente por 2 min em RT.
10. Adicionar 10 ml de meio RPMI completo e centrifugar o tubo a 400 x g durante 8 min à RT.
11. Remova o sobrenadante RPMI, quebre o pellet e ressuspenda as células com 10 ml de meio completo RPMI e conte as células K562 marcadas com CFSE.
12. Lavar os PBMC centrifugando a placa a 300 x g durante 3 min em RT. Aspirar o sobrenadante por decantação do líquido. Recoloque a tampa e bata a parte inferior da placa. Adicione 200 μl de meio RPMI completo e repita a etapa de lavagem mais uma vez.
13. Adicione células K562 marcadas com CFSE na proporção de 1:15 (100.000 K562s: 1,5 x 10⁶ PBMCs) a cada poço de amostra da placa PBMC e incube por 5 horas a 37 ° C e 5% de CO₂.
14. Lavar a mistura de células centrifugando a 300 x g durante 3 min em RT. Aspirar o sobrenadante rejeitando o líquido. Coloque a tampa e bata o fundo da placa.
15. Adicione 200 μl de tampão de corrida e repita a etapa de lavagem descrita na etapa 14 mais uma vez.
16. Adicione 95 μl de tampão corrido seguido de 5 μl de 7AAD a cada poço para um volume total de 100 μl / poço. Incubar a placa no escuro em RT durante 15 min.
17. Adicione 100 μl de tampão de corrida a cada poço e transfira todo o volume de suspensão celular de cada poço da placa para os tubos de cluster e adquira as amostras no citômetro de fluxo.
18. Determine a porcentagem de células positivas para 7AAD e CFSE positivas usando o software de análise de citometria de fluxo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
12 x 75 tubos	Falcão BD	352058
Tubos cônicos de 15 ml	Corning	Rolamento 430790
Microtubos de 2 mL	Axygen	MCT-150-C-S
Tubos cônicos de 50 ml	Corning	430828
Frasco de 500 ml	Corning	430282
7AAD	BD Pharmingen	559925
Placa de fundo plano de 96 poços	Termo Nunc	439454
Placas de fundo redondas de 96 poços	Falcão BD	353077
Capa de cultura de células	Thermo Científico	Série 1300 A2
centrifuga	Eppendorf	58110R
Atendimento ao cliente	Sondas Moleculares Tecnologias de Vida	C34554
Tubos de cluster	Corning	Nº 4401	Nocivo por ingestão, cancerígeno
DMSO (dimetilsulfóxido)	Sigma-Aldrich	D8418
DPBS	Lonza	17-512F
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Unidade de filtro	Nalgene	Rolamento 156-4020
Citômetro de fluxo	BD Biociências	FACS Canto II	8 cores em Ex 405 nm e Em785 nm.
Citômetro de fluxo	BD Biociências	FACS Calibur	4 cores em Ex 495 nm e Em 785 nm.
Software de análise de citometria de fluxo	Estrela da Árvore	FlowJo
nicotina	Sigma-Aldrich	N3876	Toxicidade aguda, perigo ambiental
Parafilme	Bemis	"M"
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	Pág. 6148	Inflamável, Irritação da pele
Caneta/estreptococo	Tecnologias Gibco Life	15140-122
RPMI 1640	Tecnologias Gibco Life	11875-093
Buffer em execução	Buffer de corrida MACS, Miltenyi Biotech	130-091-221
Pipeta de transferência	Fisher Científico	13-711-20
Base Tris	Sigma-Aldrich	T1503