1. Preparar meio sintético de fibrose quística (SCFM2)
NOTA: A preparação do SCFM2 compreende três estágios principais descritos abaixo (Figura 1).
- Esterilização de mucina suína
- Prepare mucina estéril a uma concentração final de 5 mg / mL em SCFM2. Por exemplo, para um volume de 5 mL de SCFM2, pesar 25 mg de mucina Tipo II em uma placa de Petri estéril e colocá-la em um esterilizador ultravioleta (UV) por 4 h, agitando suavemente a cada hora.
- Após 4 h, transfira a mucina tratada com UV para tubos autoclavados de 1,7 mL em condições estéreis e armazene a -20 °C.
- Para confirmar a esterilização completa, dissolva uma amostra de mucina em um líquido estéril, como água ou caldo Luria-Bertani (LB), e observe ao microscópio.
nota: A mucina esterilizada pode ser armazenada a -20 °C por até 6 meses.
- Preparação da base tamponada
- Prepare soluções de estoque de sal e aminoácidos adicionando as quantidades apropriadas em peso à água deionizada, conforme listado na Tabela 1. Filtre e esterilize todas as soluções de estoque usando um filtro de 0,22 μm, embrulhe em papel alumínio para proteger da degradação da luz e armazene a 4 ° C por até um mês.
- Prepare a base tamponada combinando 190 mL de água deionizada com soluções de aminoácidos e estoque de sal por volumes listados na Tabela 1. Ajustar a solução para pH 6,8 e aumentar até um volume final de 250 ml. Esterilize por filtro usando um filtro de 0,22 μm e armazene a 4 °C por até 30 dias.
- Na noite anterior ao experimento, alíquota a quantidade desejada de base tamponada em um frasco de cultura de vidro e adicione mucina (5 mg / mL conforme descrito na etapa 1.1.1) e DNA de esperma de salmão purificado (0,6 mg / mL). Agitar suavemente, embrulhar em papel alumínio e deixar a 4 °C durante a noite para permitir que a mucina e o ADN se dissolvam em solução.
nota: As alíquotas de DNA de esperma de salmão devem ser descongeladas em gelo, vórtices e adicionadas à base tamponada e mucina. As soluções estoque de triptofano, asparagina e tirosina devem ser preparadas em soluções de NaOH (consulte a Tabela 1 para concentrações) em vez de água deionizada. Mantenha a base tamponada e todas as soluções de estoque embrulhadas em papel alumínio para proteger da exposição à luz. A maioria dos estoques ficará estável por até um mês. Os estoques que ficam descoloridos não devem ser usados e devem ser substituídos antes do uso.
- Adição de estoques suplementares
- No dia do experimento, adicionar os estoques listados na Tabela 2 à base tamponada contendo mucina e DNA.
nota: Preparar uma nova solução de FeSO4 no dia da experiência, mas todas as outras reservas podem ser preparadas com antecedência e armazenadas durante 30 dias a 4 °C. A 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) contém clorofórmio. Manuseie com cuidado e não use perto de chamas abertas. Após a adição de DOPC, incubar SCFM2 a 37 °C com agitação (250 rpm) durante pelo menos 20 min (para cultura de 5 ml). Este período de incubação permite que o clorofórmio no DOPC evapore. O balão não deve ser hermético; Em vez disso, cubra a abertura do frasco frouxamente com papel alumínio.
2. Avaliação em tempo real da tolerância antimicrobiana em agregados bacterianos
- Prepare culturas durante a noite
- Na noite anterior ao experimento, inocular 5 mL de caldo LB com várias colônias de Pa PAO1-pMRP9-113 de uma placa de ágar LB contendo antibiótico (carbenicilina 300 μg/mL). Crescer durante a noite a 37 °C com agitação a 250 rpm.
nota: Cultive culturas durante a noite com a adição de antibióticos necessários para a seleção dos plasmídeos necessários (aqui, o plasmídeo de expressão de proteína fluorescente verde (GFP), pMRP9-1). Observe que as células Pa devem ser lavadas antes que o SCFM2 seja inoculado. LB pode ser substituído por outros meios de laboratório ricos para culturas noturnas. Todos os isolados bacterianos devem ser manuseados usando as diretrizes BSL-2 apropriadas em todo este protocolo.
- Inocular SCFM2
- No dia do experimento, diluir culturas durante a noite de Pa 1:10 (cultura: meio líquido) inoculando 500 μL em 5 mL de caldo fresco de LB. Cultive as células até a fase logarítmica (60-90 min) a 37 °C com agitação a 250 rpm.
- Centrifugue culturas em fase logarítmica a 10.000 × g por 5 min. Lave as células removendo o sobrenadante e ressuspendendo-as em 3 mL de solução salina tamponada com fosfato esterilizado por filtro (PBS, pH 7,0). Repita duas vezes e ressuspenda o pellet em um volume final de 1 mL de PBS.
- Meça a absorbância das células lavadas usando um espectrofotômetro a 600 nm (OD600) e calcule o volume de cultura necessário para um OD600 inicial de 0,05 em 5 mL de SCFM2. Inocule Pa no SCFM2 e votice suavemente para distribuir as células por toda parte. Pipetar 1 ml do SCFM2 inoculado em cada câmara de uma placa óptica de 4 poços, fundo de vidro, e incubar por 4 h estaticamente a 37 °C.
nota: O tempo de duplicação das culturas de Pa depende da tensão e da disponibilidade de oxigênio. No SCFM2, nas condições descritas aqui, o tempo de duplicação de Pa é de ~ 1,4 h.
3. Visualização de agregados durante o tratamento com antibióticos com microscopia confocal de varredura a laser (CLSM)
NOTA: Esta seção descreve o uso de microscópio confocal de varredura a laser e software de captura de imagem para a imagem de agregados de Pa em SCFM2. O objetivo é observar e caracterizar a biomassa bacteriana remanescente (tolerante) após o tratamento com antibióticos. As etapas descritas podem ser executadas com sucesso em outros microscópios confocais, embora o manual de operação do instrumento deva ser consultado para orientação específica.
- Culturas de Pa de imagem usando uma câmara aquecida ou uma microplaca aquecida instalada no estágio do microscópio para manter uma temperatura ambiente de 37 ° C. Inicie o módulo de incubação pelo menos 2 h antes do início do experimento para permitir que todos os aparelhos atinjam a temperatura desejada e reduzir a expansão e o movimento durante a coleta de dados.
- Após 4 h, transferir culturas de SCFM2 contendo células Pa para a fase de microscópio aquecido. Designar 3 dos 4 poços como réplicas técnicas para tratamento com antibióticos e considerar o 4º poço como um controle sem tratamento, contendo apenas células Pa em SCFM2, sem antibióticos. Identifique agregados usando microscopia de campo claro na guia Localizar antes de qualquer excitação de repórteres fluorescentes. Defina uma área para aquisição de imagens dentro de cada poço e armazene sua posição (coordenadas x-y-z) usando o módulo Posições no software de geração de imagens.
- Use uma objetiva de imersão em óleo de 63x para visualizar culturas de Pa contendo o plasmídeo de expressão GFP pMRP9-1 em SCFM2 com um comprimento de onda de excitação de 488 nm e comprimento de onda de emissão de 509 nm. Tire imagens usando a opção z-stack dentro do módulo de aquisição em intervalos de 1 μm (total de 60 fatias). Use o módulo Média de linha para reduzir a fluorescência de fundo no canal GFP dentro do volume total das imagens de pilha z de 60 μm (1.093,5 mm3). Tire imagens de controle de SCFM2 não inoculado usando configurações idênticas para determinar a fluorescência de fundo para análise de imagem.
nota: As imagens são adquiridas produzindo imagens de pilha z de 8 bits de 512 pixels x 512 pixels (0,26 μm x 0,26 μm pixels) a 60 μm da base da lamínula.
- Use a opção de série temporal no software de imagem para capturar 60 fatias em cada posição (poço) em intervalos de 15 minutos durante um período de 18 h. Use a estratégia de foco definido no software para armazenar um plano focal para cada posição, que é retornado em cada ponto de tempo durante o experimento.
- Após um total de 4,5 h de incubação, crie imagens de cada posição usando as configurações acima para determinar a biomassa agregada dentro de cada um dos quatro poços antes da adição de antibiótico.
- Após 6 h de incubação total, adicionar antibiótico 2x abaixo da concentração inibitória mínima (CIM) a cada replicação. Pipetar directa e suavemente para o meio do poço, logo abaixo da interfase ar-líquido. Manter todas as culturas na câmara confocal aquecida.
nota: Aqui, foi utilizado sulfato de colistina na concentração de 140 μg/mL.
- Inicie o tratamento de imagem pós-antibiótico clicando na opção Iniciar experimento no programa de imagem.
nota: A concentração de antibióticos usada depende do antibiótico, do isolado de Pa e se o usuário gostaria de examinar os efeitos de morte ou tolerância. Este experimento usa uma dose única. Doses adicionais podem ser adicionadas sem interromper as culturas, se necessário.
4. Coloração com iodeto de propídio de agregados de Pa
NOTA: O iodeto de propídio (PI) é comumente utilizado como reagente de coloração para identificar células bacterianas não viáveis (mortas) em cultura. Aqui, ele é usado para identificar agregados sensíveis ao tratamento com antibióticos aplicado na seção 3. Ao longo deste protocolo, a expressão e detecção de GFP em células Pa é usada como o principal proxy para a viabilidade celular. Esta etapa final permite que a imagem confocal seja usada mais uma vez para identificar o posicionamento espacial de agregados vivos/mortos em relação uns aos outros. Além disso, os agregados são identificados como vivos/mortos para posterior classificação de células a jusante na seção 3.
- Após 18 h, adicionar PI a cada alvéolo da placa óptica de fundo de quatro câmaras contendo culturas SCFM2. Siga as instruções do fabricante para o volume de PI e o tempo de incubação (por exemplo, ~ 2 μL por mL de cultura, ~ 20-30 min).
5. Isolando células vivas de agregados usando uma abordagem de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)
NOTA: O FACS apresenta uma plataforma poderosa para classificar e isolar grupos de células de acordo com um fenótipo marcado com fluorescência. Aqui, o FACS é usado para isolar agregados vivos (tolerantes a antibióticos) de agregados não viáveis.
- Após a coloração com iodeto de propídio, retirar as culturas da incubação e transferi-las para um instrumento FACS num recipiente isolado para manter 37 °C.
- Executar alíquotas de 1 mL de SCFM2 contendo agregados de Pa na menor vazão.
nota: Cada alíquota conterá ~ 15.000 agregados.
- Para detectar GFP, ilumine as células com um laser de 488 nm e registre a altura do sinal fluorescente em 530/30 nm. Visualize a coloração PI por excitação com um laser de 561 nm e registre a altura do sinal fluorescente em 610/20 nm. Execute a classificação usando um bico de 70 u.
nota: As agregações classificadas podem ser agrupadas de várias maneiras, dependendo do aplicativo do usuário. Nesse caso, o FACS foi usado para classificar agregados viáveis de Pa para sequenciamento de RNA a jusante.
Tabela 1: Preparação de estoques de sal, aminoácidos, DNA e mucina necessária para base tamponada de meio sintético de escarro de fibrose cística, SCFM2.
| químico | Concentração de Estoque (M) | Concentração final (mM) | anotações |
| NaH2PO4 | 0,2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0,2 | 1.25 | |
| KNO3 | 1 | 0,35 | |
| K2SO4 | 0,25 | 0,27 | |
| NH4Cl | | 2.28 | Adicione sólido diretamente à base tamponada |
| Kcl | | 14.94 | Adicione sólido diretamente à base tamponada |
| NaCl | | 51,85 | Adicione sólido diretamente à base tamponada |
| Mops | | 10 | Adicione sólido diretamente à base tamponada |
| Sor | 0,1 | 1,45 | |
| Glu HCl | 0,1 | 1,55 | |
| pró | 0,1 | 1,66 | |
| Gly | 0,1 | 1.2 | |
| Ala | 0,1 | 1,78 | |
| Val | 0,1 | 1.12 | |
| Conheci | 0,1 | 0,63 | |
| Ile | 0,1 | 1.12 | |
| Leu | 0,1 | 1.61 | |
| Orn HCl | 0,1 | 0,68 | |
| Lys HCl | 0,1 | 2.13 | |
| Arg HCl | 0,1 | 0,31 | |
| Trp | 0,1 | 0,01 | Preparado em NaOH 0,2 M |
| áspide | 0,1 | 0,83 | Preparado em NaOH 0,5 M |
| Tyr | 0,1 | 0,8 | Preparado em NaOH 1,0 M |
| Thr | 0,1 | 1.07 | |
| Cys HCl | 0,1 | 0,16 | |
| Phe | 0,1 | 0,53 | |
| Seu HCl H2O | 0,1 | 0,52 | |
| DNA de esperma de salmão | | 0,6 mg/ml | |
| Mucina suína | | 5 mg/nL | |
Tabela 2: Preparação de estoques adicionais necessários para base tamponada de meio sintético de escarro de fibrose cística, SCFM2.
| químico | Concentração de estoque (M) | Concentração final (mM) | anotações |
| Dextrose (D-glu2cose) | 1 | 3 | |
| Ácido L-láctico | 1 | 9.3 | Ajuste para pH 7,0 com NaOH |
| CaCl2*H2O | 1 | 1,75 | |
| MgCl2*6H2O | 1 | 0,61 | |
| FeSO4*7H2O | 1 mg/ml | 0,0036 | Faça fresco diariamente |
| N-acetilglucosamina | 0,25 | 0,3 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) | 25 mg/ml | 100 μg/mL | Incubar durante pelo menos 20 min a 37 °C após a adição |
