Quantificação da infecção bacteriana em células hospedeiras pelo ensaio da unidade formadora de colônias

Resumo

Fonte: Gayle, P. et al., Usando um patógeno bacteriano para sondar as respostas do hospedeiro em nível celular e organísmico.J. Vis. Exp.(2019).

Este vídeo demonstra uma técnica de quantificação in vitro para determinar a infecção de macrófagos por Listeria monocytogenes pelo ensaio de unidade formadora de colônias. As colônias bacterianas na placa de ágar representam a população bacteriana intracelular que escapa do mecanismo de defesa do hospedeiro e sobrevive dentro dos macrófagos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparando células para infecção

1. Propagar a linha celular semelhante a macrófagos de camundongo RAW 264.7 em meios de cultura de tecidos DMEM suplementados com 10% de soro fetal de bezerro (doravante denominado DMEM/FCS) usando um frasco de 125 mL e uma incubadora de cultura de tecidos mantida a 37 °C/5% CO₂.
2. No dia anterior à infecção, use um raspador de células para remover as células do frasco de expansão e colete-as em um tubo cônico com tampa de rosca de 15 mL. Centrifugue as células a 800 x g por 10 min, decanta o sobrenadante, suspende o pellet celular em 1 mL de DMEM/FCS (sem antibióticos) e determina o título usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado.
3. Ajuste o título para 2 x 10⁶ células/mL e adicione 0,10 mL (2 x 10⁵ células) aos poços de uma placa de cultura de tecidos de 48 poços. Certifique-se de que a suspensão da célula cubra toda a superfície do poço.
   1. Células de placa em poços adicionais para uma fonte posterior de meio condicionado. Além disso, coloque 0,10 mL de DMEM/FCS em três poços adicionais para servir como um 'controle sem célula'.
4. Incubar durante a noite em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C / 5% CO₂. No dia seguinte, não retire da incubadora até que o inóculo da bactéria esteja preparado e pronto para uso.

2. Preparando Listeria monocytogenes (Lm) para infecção

1. Inocular 2 ml de perfusão cérebro-coração (BHI) com uma única colónia de uma placa de ágar-ágar recém-listrada (<2 dias) de Lm e incubar durante a noite a 37 °C com agitação a 130 rotações/min.
2. No dia seguinte, adicione 0,10 mL de cultura noturna a 2 mL de BHI pré-aquecido e continue incubando a 37 ° C com agitação até que a densidade óptica (OD₆₀₀) esteja entre 0,4 e 0,6.
3. Determine o título bacteriano aproximado usando uma fórmula de conversão derivada empiricamente. Em nosso laboratório, uma cultura de Lm em crescimento exponencial em BHI é de aproximadamente 1,3 x 10⁹ unidades formadoras de colônias (UFC) / OD₆₀₀. Minimize a quantidade de tempo que as culturas bacterianas são expostas à temperatura ambiente.
4. Pouco antes da infecção, ajuste o título para 5 x 10⁷ UFC / mL usando DMEM / FCS pré-aquecido como diluente.

3. Infecção

1. Trabalhando com rapidez e precisão, adicione 20 μL (1 x 10⁶ UFC; multiplicidade de infecção, MOI = 5) do inóculo Lm recém-preparado (etapa 2.4 acima) aos alvéolos inclinando levemente o prato e colocando cuidadosamente a ponta da pipeta no meio sobrejacente;
   NOTA: Evite tocar nas paredes do poço com a ponta da pipeta.
2. Pipete suavemente o conteúdo de cada poço para garantir a mistura completa; não agite ou incline significativamente a placa, pois isso espalhará Lm sobre as paredes do poço. Retorne a placa de cultura de células para uma incubadora de 37 °C/5% de CO₂.
3. Preparar uma solução de gentamicina a 10 μg/ml utilizando meios condicionados de alvéolos não infectados como diluente.
4. 30 minutos após a infecção (mpi), adicione cuidadosamente 30 μL da solução de gentamicina (concentração final de 2,5 μg / mL) e pipete suavemente o conteúdo do poço como antes e retorne a placa de cultura de células à incubadora de 37 ° C / 5% de CO₂.
5. A 60 mpi, colher poços apropriados para o ensaio de UFC (ponto de tempo de 60 mpi) ou análise de FCM (conforme descrito abaixo nas seções 4 e 5, respectivamente).
6. Para os poços restantes, em vários momentos posteriores, colha as células como antes ou, para o ensaio de emergência de Ml, remova totalmente o meio do poço e substitua-o por 150 μL de meio condicionado sem gentamicina.

4. Processamento de Amostragem e Análise de Lm Intracelular e Emergente por Ensaio CFU

1. Para colher, incline levemente o prato e remova cuidadosamente todo o meio do poço. Adicione 0,50 mL de água estéril destilada (dsH₂O) ao poço. Após 30 s, transfira o lisado de água resultante (10⁰) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e vortex vigorosamente por 10 s.
2. Preparar diluições ^10-1 e ^10-2 adicionando 4,5 μL ou 50 μL do lisado de água a 450 μL de dsH₂O e vórtice breve para garantir uma mistura completa.
3. Espalhe 50 μL das amostras 10⁰, ^10-1 e / ou ^10-2 em placas de ágar caldo de lisogenia (LB).
4. Para analisar o Lm emergente (passo 3.6 acima), remova 10 μL do meio de sobreposição e divida-o em duas alíquotas de 5 μL: a uma alíquota adicione 5 μL de DMEM/FCS e à segunda alíquota adicione 5 μL de DMEM/FCS contendo 5 μg/mL de gentamicina. O último controle distingue entre Lm extracelular (sensível à gentamicina) e Lm intracelular (resistente à gentamicina) no ensaio subsequente de UFC.
5. Após 5 min à temperatura ambiente, adicione 90 μL de dsH₂O, vortex vigorosamente por 10 s e espalhe 50 μL em placas de ágar LB.
6. Enumerar as colónias de Lm em placas de ágar-LB após 2 dias de incubação a 37 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caldo BHI (Infusão Cérebro Coração)	EMD Milipore	110493
Mídia DMEM	Gibco	11965-092
FBS - Inativado por calor	Sigma-Aldrich	Rolamento F4135-500ML
ágar LB	Cultivar células MS	MBPE-4040
Placas de 48 poços para cultura de tecidos TPP	MEIO	TP92048