Análise de citometria de fluxo de Listeria monocytogenes intracelular e extracelular emergente in vitro

Resumo

Fonte: Gayle, P. et al., Usando um patógeno bacteriano para sondar as respostas do hospedeiro em nível celular e organísmico. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, quantificamos Listeria monocytogenes intracelulares e extracelulares, uma bactéria patogênica intracelular, após a infecção de macrófagos cultivados in vitro usando citometria de fluxo.

Protocolo

1. Processamento de Amostragem e Análise de Lm Intracelular e Emergente por Citometria de Fluxo (FCM)

1. Preparar a linhagem celular RAW 264.7 semelhante a macrófagos de ratinho em meios de cultura de tecidos DMEM suplementados com 10% de soro fetal de vitelo (doravante denominado DMEM/FCS) utilizando um balão de 125 ml e uma incubadora de cultura de tecidos mantida a 37 °C/5% de CO₂. Ajuste as células para 1 x 10⁶ células/mL e adicione 1 mL (1 x 10⁶ células) aos poços de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços.
2. Preparar o inóculo da bactéria Listeria monocytogenes, Lm, e infectar as células com o volume de inóculo correspondente a um MOI de 50 (5 x 10⁷ UFC).
3. Às 1,5 horas pós-infecção (hpi), colete o meio do primeiro conjunto de poços e coloque em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 500 μL de paraformaldeído a 4% (PFA) e coloque no gelo até que todos os poços tenham sido processados.
4. Para coletar Lm intracelular, adicione 1 mL de ds H₂O ao poço e, após 60 s, transfira o lisado de água resultante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 500 μL de 4% de PFA. Vortex vigorosamente por 10 segundos e coloque no gelo até que todos os poços tenham sido processados.
5. Para os poços restantes, remova o meio e substitua por 1 mL de DMEM/FCS por 5 μg/mL de gentamicina para matar o Lm extracelular e devolver imediatamente as células à incubadora.
6. Após 30 min (2 hpi), remova o meio e substitua por DMEM/FCS sem gentamicina.
7. Após 2 e 4 h (4 e 6 hpi), obtenha o segundo e terceiro pontos de tempo coletando meios e lisados.
8. Tubos de centrífuga a 10.000 x g por 7 min. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet.
9. Suspenda cada pellet em um coquetel de coloração de 50 μL de 4% de PFA e 15 μL de faloidina. Incubar os tubos no escuro a 4 °C durante 20 min.
10. Após a incubação, adicione 1 mL de tampão FACS a cada tubo e pipete para cima e para baixo para misturar.
11. Gire os tubos a 10.000 x g por 7 min. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet.
12. Suspenda cada pellet em 400 μL de tampão FACS para uso imediato, ou 200 μL de tampão FACS e 200 μL de PFA a 4% se armazenar para análise posterior.
13. Execute amostras em citometria de fluxo e analise os dados coletados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caldo BHI (Infusão Cérebro Coração)	EMD Milipore	110493
Filtro de células, 70 μm	VWR	10199-656
Colagenase D	Roche	11088858001
Mídia DMEM	Gibco	11965-092
Tubos FACS	Falcão BD	352054
FBS - Inativado por calor	Sigma-Aldrich	Rolamento F4135-500ML
Solução salina balanceada de Hanks	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
ágar LB	Cultivar células MS	MBPE-4040
Kit de coloração de células mortas amarelas corrigíveis LIVE/DEAD	Tecnologias da Vida	L349S9
Rodamina Faloidina	Thermo Fischer	R415
Analisador Espectral SP6800	Sony
Placas de 48 poços para cultura de tecidos TPP	MEIO	TP92048
Placas de 6 poços para cultura de tecidos TPP	MEIO	TP92406