1. Colete e prepare moscas
- Drosophila melanogaster traseira nas condições experimentais desejadas. Tome cuidado para não superlotar as moscas durante a criação e certifique-se de que as densidades larvais sejam consistentes entre os tratamentos, pois as condições ambientais durante o estágio larval podem afetar profundamente os fenótipos de defesa imunológica durante o estágio adulto.
- Colete moscas experimentais 0 - 3 dias após a eclosão da caixa de pupa e transfira-as para um meio fresco.
- Alojar as moscas coletadas na temperatura desejada (temperaturas entre 22 °C e 28 °C são geralmente adequadas) até que tenham 5 a 7 dias de idade após a eclosão.
nota: Isso permite tempo suficiente para as moscas completarem a metamorfose e se tornarem adultos maduros, mas é bem antes do início da senescência.
- Separe o número desejado de moscas em um frasco separado antes da infecção, novamente tomando cuidado para evitar superlotação.
nota: Apenas os machos estão infectados nesta demonstração, mas é igualmente possível infectar as fêmeas usando o procedimento descrito.
2. Cultura e preparação de bactérias
- Prepare uma placa mestra da bactéria escolhida pelo menos 2 dias antes da infecção. Retire as bactérias de um estoque de glicerol a 15% armazenado indefinidamente a -80 °C. Armazene a placa principal a 4 °C por até 2 semanas. Sempre risque as placas mestras diretamente do estoque de glicerol congelado. Evite a passagem em série de bactérias de placa em placa, pois a passagem repetida na cultura pode fazer com que as bactérias evoluam virulência atenuada.
nota: Este exemplo faz uso de Providencia rettgeri e Escherichia coli.
- Use o procedimento a seguir para preparar uma suspensão bacteriana para injeção.
- Cultivar uma cultura de 2 ml de bactérias inoculando um meio estéril com uma única colónia isolada da placa principal. Cultive as bactérias até a fase estacionária (por exemplo, crescimento O/N a 37 °C).
nota: Tanto P. rettgeri quanto E. coli crescem bem em caldo Luria em temperaturas de 20 a 37 ° C com agitação suave.
- Quando a cultura atingir a fase estacionária, pulverize suavemente as células de aprox. 600 μl da cultura em uma centrífuga de mesa (3 min a 5.000 x g), descarte o sobrenadante e ressuspenda as bactérias em aprox. 1.000 μl de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS; cloreto de sódio 137 mM, NaCl, cloreto de potássio 2,7 mM, KCl, 10 mM de fosfato de sódio, Na2PO4, 1,8 mM de di-hidrogenofosfato de potássio, KH2PO4, pH = 7,4).
- Diluir as células ressuspensas em PBS estéril para obter uma densidade óptica (DO) apropriada para a bactéria em uso, medida com um espectrofotômetro como absorbância a 600 nm. Use esta suspensão para infectar as moscas.
nota: Um600 = 0,1 ou 1,0 corresponde, respectivamente, a aproximadamente 108 e 109 Providencia rettgeri ou E. coli por ml. Como as bactérias vivas e mortas contribuem para a densidade óptica, é importante colher culturas no início da fase estacionária, antes que os cadáveres bacterianos se acumulem e distorçam a relação entre a densidade óptica e o número de bactérias viáveis introduzidas durante a infecção.
3. Infecte as moscas
NOTA: Como a imunidade da Drosophila é influenciada pelo ritmo circadiano, é importante realizar infecções em um horário semelhante do dia em réplicas experimentais.
- Usando um Nanoinjetor
- Prepare as agulhas de vidro para infecção.
- Prepare uma agulha de vidro puxando um capilar de vidro de borossilicato usando um extrator de micropipeta.
- Usando uma pinça, quebre a ponta da agulha para criar uma abertura de aproximadamente 50 μm de diâmetro para permitir a ejeção do líquido.
- Monte o injetor.
- Coloque o O-ring de vedação e, em seguida, o espaçador branco (covinha grande voltada para fora) no êmbolo de metal.
- Encha a agulha de vidro com óleo mineral usando uma seringa com uma agulha de 30 G.
- Coloque a agulha de vidro cheia na pinça e, em seguida, coloque o anel de vedação maior ao redor de sua base, a cerca de 1 mm da extremidade cega da agulha.
- Deslize a agulha no êmbolo de metal e aperte suavemente a pinça até ficar firme.
- Ejete a maior parte do óleo mineral do injetor, mas certifique-se de que ainda haja um pequeno volume de óleo na agulha para atuar como uma barreira entre o injetor e a suspensão bacteriana. Certifique-se de que não haja bolhas de ar dentro do óleo mineral ou suspensão bacteriana, ou entre os dois líquidos.
- Defina o injetor para o volume desejado para injeção (entre 9 nl e 50 nl).
- Gere controles de ferimentos.
- Encha a agulha injetora com PBS estéril inserindo cuidadosamente a ponta da agulha capilar em um tubo do meio e pressionando o botão "encher" no injetor.
nota: Meios de crescimento bacteriano estéreis também podem ser usados como controle de feridas se o experimento exigir injeção de bactérias suspensas em seu meio de crescimento. No entanto, como o meio de crescimento bacteriano contém componentes que podem estimular o sistema imunológico ou ter outros efeitos no hospedeiro, um transportador inerte como o PBS é preferível.
- Anestesie o número desejado de moscas sob um leve fluxo de dióxido de carbono (CO2).
- Injete as moscas no abdômen anterior na superfície ventrolateral com o PBS estéril.
nota: Também é possível injetar moscas em outros locais, como a placa esternopleural do tórax, mas é importante manter o local da injeção consistente em cada experimento.
- Coloque as moscas injetadas em frascos novos com um novo meio, colocando-os de lado até que todas as moscas tenham se recuperado da anestesia para evitar que as moscas fiquem presas à comida.
nota: Recomenda-se injetar as moscas de controle PBS antes de injetar bactérias em moscas experimentais para que a mesma agulha possa ser usada para ambos os tratamentos. Nem sempre será possível usar a mesma agulha para um experimento inteiro. Nesse caso, pode ser desejável registrar qual agulha foi usada com quais moscas e incluir a identidade da agulha como um fator experimental na análise estatística.
- Injete o patógeno bacteriano.
- Ejete o meio estéril restante do injetor e reabasteça a mesma agulha com a suspensão bacteriana.
- Repetir o procedimento acima (3.1.3), injectando agora nas moscas a suspensão bacteriana preparada no procedimento 2.2.
