1. Colete e prepare moscas
- Traseira D. melanogaster nas condições experimentais desejadas. Tome cuidado para não superlotar as moscas durante a criação e certifique-se de que as densidades larvais sejam consistentes entre os tratamentos, pois as condições ambientais durante o estágio larval podem afetar profundamente os fenótipos de defesa imunológica durante o estágio adulto.
- Colete moscas experimentais 0 - 3 dias após a eclosão da caixa de pupa e transfira-as para um meio fresco.
- Alojar as moscas coletadas na temperatura desejada (temperaturas entre 22 °C e 28 °C são geralmente adequadas) até que tenham 5 a 7 dias de idade após a eclosão.
nota: Isso permite tempo suficiente para as moscas completarem a metamorfose e se tornarem adultos maduros, mas é bem antes do início da senescência.
- Separe o número desejado de moscas em um frasco separado antes da infecção, novamente tomando cuidado para evitar superlotação.
nota: Apenas os machos estão infectados nesta demonstração, mas é igualmente possível infectar as fêmeas usando o procedimento descrito.
2. Cultura e preparação de bactérias
- Prepare uma placa mestra da bactéria escolhida pelo menos 2 dias antes da infecção. Retire as bactérias de um estoque de glicerol a 15% armazenado indefinidamente a -80 °C. Armazene a placa principal a 4 °C por até 2 semanas. Sempre risque as placas mestras diretamente do estoque de glicerol congelado. Evite a passagem em série de bactérias de placa em placa, pois a passagem repetida na cultura pode fazer com que as bactérias evoluam virulência atenuada.
nota: Este exemplo faz uso de Providencia rettgeri e Escherichia coli.
- Use o procedimento a seguir para preparar uma suspensão bacteriana para injeção.
- Cultivar uma cultura de 2 ml de bactérias inoculando um meio estéril com uma única colónia isolada da placa principal. Cultive as bactérias até a fase estacionária (por exemplo, crescimento de O/N a 37 °C).
nota: Tanto P. rettgeri quanto E. coli crescem bem em caldo Luria em temperaturas de 20 a 37 ° C com agitação suave.
- Quando a cultura atingir a fase estacionária, pulverizar suavemente células de aprox. 600 μl da cultura em uma centrífuga de mesa (3 min a 5.000 x g), descartar o sobrenadante e ressuspender as bactérias em aprox. 1.000 μl de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4, pH = 7,4).
- Diluir as células ressuspensas em PBS estéril para obter uma densidade óptica (DO) apropriada para a bactéria em uso, medida com um espectrofotômetro como absorbância a 600 nm. Use esta suspensão para infectar as moscas.
nota: A600 = 0,1 ou 1,0 corresponde, respectivamente, a aproximadamente 108 e 109 Providencia rettgeri ou E. coli por ml. Como as bactérias vivas e mortas contribuem para a densidade óptica, é importante colher culturas no início da fase estacionária, antes que os cadáveres bacterianos se acumulem e distorçam a relação entre a densidade óptica e o número de bactérias viáveis introduzidas durante a infecção.
3. Infecte as moscas
NOTA: Como a imunidade da Drosophila é influenciada pelo ritmo circadiano, é importante realizar infecções em um horário semelhante do dia em réplicas experimentais.
- Com picada de agulha séptica
- Prepare a agulha para picar.
- Derreta a extremidade de uma ponta de micropipeta de 200 μl e insira um pino de inseto de 0,15 mm no plástico fundido. Deixe o plástico solidificar de forma que o pino seja mantido no lugar com aproximadamente 0.5 cm do pino estendendo-se do plástico.
- Gere controles de ferimentos.
- Anestesiar o número desejado de moscas sob um fluxo de luz de CO2.
- Pique as moscas na placa esternopleural do tórax com a agulha, evitando os locais de fixação das asas e das pernas. Se necessário, remova suavemente as moscas do pino minuciano usando uma pinça macia.
nota: Também é possível picar as moscas em outros locais, como o abdômen anterior na superfície ventrolateral, mas é importante manter o local da injeção consistente em cada experimento. Picar a cutícula do abdômen tende a ser mais difícil do que picar o tórax e, portanto, é menos comum.
- Coloque as moscas picadas em um frasco novo com um novo meio de mosca, colocando o frasco de lado até que todas as moscas tenham se recuperado da anestesia para evitar que as moscas fiquem presas à comida.
- Introduza a infecção bacteriana.
- Anestesiar o número desejado de moscas sob um fluxo de luz de CO2.
- Pique cada mosca no mesmo local que os controles do meio, mergulhando a ponta do pino na suspensão bacteriana preparada no procedimento 2.2 antes de picar cada mosca.
- Coloque as moscas picadas em um frasco novo com um novo meio de mosca, colocando o frasco de lado até que todas as moscas tenham se recuperado da anestesia para evitar que as moscas fiquem presas à comida.