Medindo a carga bacteriana de E. coli em Drosophila melanogaster após infecção por E. coli

Resumo

Fonte: Khalil, S., et al. Infecção bacteriana sistêmica e fenótipos de defesa imunológica em Drosophila Melanogaster. J. Vis. (2015)

Neste vídeo, demonstramos uma técnica para medir a carga bacteriana de E. coli após a injeção de E. coli no tórax de Drosophila melanogaster.

Protocolo

1. Ensaio de carga bacteriana pós-infecção

1. Meça a carga bacteriana.
   1. Em um horário prescrito após a injeção, coloque cada mosca em um tubo de microcentrífuga no gelo.
   2. Adicione 250 μl de PBS a cada tubo e homogeneize as moscas usando um pilão ou um batedor de contas.
   3. Colocar o homogeneizado numa placa de ágar LB, utilizando uma chapa espiral ou uma diluição em série.
      1. Para a placa usando diluição serial, transfira cada homogeneizado de mosca para a primeira linha de uma placa de 96 poços.
      2. Encher cada alvéolo das restantes linhas com 90 μl de PBS.
      3. Utilizando uma pipeta multicanal, retirar 10 μl da primeira fila contendo homogenato de mosca e dispensar na segunda fila.
      4. Pipetar para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar bem e, em seguida, tomar 10 μl e transferir para a terceira fila. Repita este procedimento usando as linhas restantes.
      5. Começando pela linha inferior (suspensão de bactérias mais diluídas), use a pipeta multicanal para retirar 10 μl de cada poço e depositar em uma placa LB, cuidando para que as amostras sejam dispensadas como pontos discretos que não se toquem. Repetir até que todos os alvéolos tenham sido recolhidos de cada linha, distribuindo-os por ordem decrescente de diluição na placa LB.
      6. Deixe a placa em RT até que as manchas estejam completamente encharcadas na placa LB.
         nota: Recomenda-se secar a placa LB por alguns dias em RT antes do uso para garantir que o líquido seja prontamente absorvido, minimizando as chances de contato acidental entre os pontos de amostra.
   4. Incube as placas O/N, tomando cuidado para não crescer demais para que as colônias permaneçam pequenas e discretas.
      nota: Dependendo do meio de crescimento bacteriano e da temperatura de incubação utilizada, as colônias derivadas da microbiota intestinal endógena da mosca podem eventualmente aparecer na placa. No entanto, a maioria das bactérias usadas para infecção patogênica cresce muito mais rápido do que a microbiota intestinal em ágar LB a 37 °C.
   5. Remova as placas da incubadora quando as bactérias experimentais tiverem crescido colônias visíveis (normalmente 8 a 12 horas), mas antes que as colônias da microbiota intestinal de Drosophila apareçam (aproximadamente 36 horas). Para bactérias experimentais de crescimento lento, use um antibiótico seletivo no ágar LB para remover quaisquer colônias da microbiota intestinal.
   6. Conte o número de colônias para cada homogeneizado.
      1. Para placas espirais, conte as colônias que crescem usando um contador de colônias automatizado que pode estimar a carga bacteriana por ml de homogenato com base no número e na posição das colônias na placa.
         NOTA: As contagens espirais são mais precisas quando a concentração bacteriana está na faixa de 5 x 10² a 5 x 10⁴ bactérias por ml.
      2. Para placas pontuais, contar manualmente as colónias para cada mosca de qualquer diluição que contenha 30 - 300 colónias e calcular o número de bactérias por ml de homogeneizado original.
2. Analise os dados.
   1. Se a carga bacteriana não for normal, transforme os dados para melhor aproximar uma distribuição normal ou analise os dados usando análise estatística não paramétrica (por exemplo, teste U de Mann-Whitney). Use uma análise de Box-Cox para encontrar a transformação ideal; As transformações de log natural ou de base -10 geralmente são eficazes.
   2. Se os dados estiverem suficientemente distribuídos e houver apenas dois tratamentos sendo contrastados, execute um teste t para determinar se os dois tratamentos resultam em cargas bacterianas médias diferentes. Se houver várias variáveis experimentais ou outros fatores potencialmente preditivos, use a Análise de Variância (ANOVA) para determinar quais fatores são preditores significativos de carga bacteriana.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Petri com Tampas Transparentes, Cume Elevado; 100 x 15 mm;	VWR internacional	Rolamento 25384-302
LB Agar, Miller	Difco	Rolamento 244520
Alça de inoculação	VWR internacional	80094-488
Tubos de microcentrífuga de 1,5mL; Rito de Selo	EUA Scientific Inc.	1615-5500
pilão motorizado; Agitador de Laboratório Talboys	Troemner	103
Homogeneizador de alto rendimento Talboys	Diagnóstico OPS	930145
5/32 '' bolas de moagem	Diagnóstico OPS	GBSS 156-5000-01
Gênio do Vórtice	Indurstries científicos inc.	G560
Pipetador multicanal (10uL-300uL)	Sartorius	Rolamento 730360
Chapa Espiral Automatizada WASP2 Whitley	Microbiologia Internacional
Contador de colônias automatizado ProtoCOL / contador de placas / leitor de placas	Microbiologia Internacional
incubadora	Poderes Científicos, Inc	DROS52SD