Ensaio para determinar a dose infecciosa do vírus Drosophila C em células de insetos cultivadas

Resumo

Fonte: Yang, S. et al., Estabelecimento da Infecção Viral e Análise da Interação Hospedeiro-Vírus em Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de efeito citopático para determinar a dose viral infecciosa de cultura de tecidos do vírus Drosophila C em células Drosophila S2*. Uma variedade de concentrações virais é usada para infectar as células cultivadas. A proporção de células que exibem alterações estruturais é determinada e esses dados são usados para calcular a dose infectante da cultura de tecidos.

Protocolo

1. Medida da carga do vírus Drosophila C pelo ensaio CPE

1. Escolha 5 tubos aleatórios contendo vírus para determinar a dose infecciosa média de cultura de tecidos virais (TCID₅₀) por um ensaio de efeito citopático (CPE) (1 unidade de TCID₅₀ = 0,7 unidade formadora de placa [PFU]).
   nota: CPE refere-se a mudanças estruturais nas células hospedeiras causadas pela invasão viral. O vírus infectante causa lise da célula hospedeira ou quando a célula morre sem lise devido à incapacidade de se reproduzir.
2. No dia 1, colete células S2 * preparadas por pipetagem. Conte o número da célula. Centrifugue as células por 300 x g por 4 min e descarte o sobrenadante. Diluir as células até a densidade de 1 x 10⁶ células/mL com um meio completo para células S2*.
3. Semeie 1 x 10⁵ células S2 * (100 μL) por poço na placa de fundo plano de 96 poços (~ 30% de confluência).
4. Realize diluições seriais de 10 vezes do estoque de DCV com meio completo para células S2 *. Adicione diluições de 50 μL no poço. Adicionar 50 μL de meio de cultura sem vírus ao poço classificado como poço controle negativo.
   nota: Para cada taxa de diluição, foram utilizados 8 poços. Como o rendimento típico do DCV é de cerca de 10^{8-10 9} PFU/mL, a diluição deve cobrir pelo menos ~10^{−5-10−10.}
5. No dia 4, observe o CPE com um microscópio de campo claro com uma objetiva de 20X ou 40X. Classifique um poço em que as células parecem embaçadas e o meio está cheio de fragmentos como um "poço positivo", e um poço em que a morfologia celular é normal como um "poço negativo".
6. Marque os poços CPE positivos ou negativos com + ou –, respectivamente. Calcule o vírus TCID₅₀ pelo método de Reed e Muench.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	marca	Rolamento 352070
Placa de cultura de células de 10 cm	sigma	CLS430167	Cultura de células
Incubadora de células	Sanyo	MIR-553
centrifuga	Eppendorf	5810R
centrifuga	Eppendorf	5424R
Incubadora de Drosophila	Percival	I-41NL	Criação de Drosophila
FBS	Invitrogen	12657-029	Cultura de células
Meio de inseto de Schneider	sigma	S9895	Cultura de células
Software estatístico	GraphPad Prisma 7
Placa de fundo plano de 96 poços	sigma	CLS3922	Cultura de células
Incubadora de células	Sanyo	MIR-553
microscópio	Olimpo	CKX41