Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Colheita de Medula Óssea
- Remova assepticamente o fêmur e a tíbia de um camundongo e limpe os ossos usando instrumentos estéreis. Coloque os ossos limpos em meio de águia modificado com Dulbecco (DMEM) + 5 mM de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico (HEPES) + 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM de 2-mercaptoetanol + 50 mg/mL de sulfato de gentamicina + 10.000 U/mL de penicilina/estreptomicina + 10% de soro fetal bovino (FBS, DMEM-10 completo) e incube o tubo em gelo por 15 min.
- Remova as articulações esféricas proximais e distais usando uma tesoura. Insira uma agulha de 25 G conectada a uma seringa de 10 mL cheia de meio na cavidade dos ossos. Lave a medula óssea usando DMEM-10 completo. Ressuspenda quaisquer aglomerados pipetando o meio para cima e para baixo suavemente.
- Centrifugue as células por 10 min a 300 x g e conte o número de células usando um hemocitômetro. Neste ponto, congele as células usando 90% de FBS + 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) ou coloque as células em uma placa de Petri de 15 cm para diferenciar macrófagos usando meio condicionado L929 (etapa 2.1).
2. Diferenciação de macrófagos derivados da medula óssea
- Usando meio de diferenciação pré-aquecido (21 mL de DMEM-10 completo e 9 mL de meio condicionado por células L929, conforme descrito por Swanson et al.), coloque as células da medula óssea em uma placa de Petri não tratada com cultura de tecidos de 15 cm (1,2-1,5 x 107 células). Incubar a placa a 37 °C e 5% de dióxido de carbono, ou CO2, durante 7 dias. Adicione mais 30 mL de meio de diferenciação à placa no dia 3 ou 4.
nota: É importante não usar placas tratadas com cultura de tecidos, pois os macrófagos serão difíceis de desprender e colher.
- Para coletar macrófagos, lave a placa com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adicione 20 mL de PBS frio + 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Incubar a placa a 4 °C durante 10 min. Colha as células pipetando o PBS + EDTA sobre as células e lavando a placa com 10 mL de PBS. Combine as duas lavagens em dois tubos cônicos de 15 mL.
- Centrifugue as células a 300 x g por 10 min e ressuspenda as células em 10 mL de DMEM livre de vermelho de fenol + 5 mM HEPES + 0,2 mg / mL de L-glutamina + 0,05 mM de 2-mercaptoetanol + 5% FBS (DMEM-5) e conte as células usando um hemocitômetro ou um contador de Coulter. Mantenha as células congeladas durante a contagem.
- Semeie os macrófagos em placas revestidas com cultura de tecidos a 2 x 105 células / mL. Para experimentos de microscopia, semeie 1 mL de células em lamínulas em placas de 24 poços. Para ensaios de liberação de lactato desidrogenase (LDH), semeie 100 μL de células em uma placa de 96 poços. Para o ensaio de LDH, semear 9 poços (3 poços não tratados, 3 poços com 100% de controles de lise e 3 poços para o estímulo experimental).
- Centrifugue a placa de 96 poços por 5 min a 300 x g para garantir que as células estejam igualmente distribuídas pelo poço.
- Incubar a placa durante a noite a 37 °C + 5% de CO2 antes de iniciar o processo de preparação.
3. Preparação
- Substitua o meio por meio fresco (DMEM-5) contendo 100 ng/mL de lipopolissacarídeo ou LPS (500 μL para a placa de 24 poços ou 50 μL para a placa de 96 poços).
nota: Há uma variedade de variações estruturais no LPS, que afetam a capacidade de estimular o priming mediado por TLR4. O LPS de Salmonella minnesota R595 (Re) está disponível em vários fornecedores e é recomendado.
- Incubar a placa durante 3 h a 37 °C e 5% de CO2.
4. Ativação do Inflamassoma NLRP3 com Nigericina e Marcação com FAM-YVAD-FMK
- Remova o meio e substitua-o por 290 μL de DMEM-5 contendo 5 μM de nigericina e 5 mM de glicina. A glicina é adicionada para reduzir a quantidade de lise celular que ocorre durante a ativação da caspase-1. Incubar durante 60 min a 37 °C e 5% de CO2. Use macrófagos do tipo selvagem e deficientes em caspase-1 para garantir que a marcação observada seja específica para a caspase-1.
- Durante os últimos 45 minutos, adicione 10 μL de 30x FAM-YVAD-FMK, preparado de acordo com as instruções do fabricante.
- Após 60 min, remova o meio e lave as células três vezes por 5 min cada com 1 mL de PBS frio.
- Adicione 250 μL de paraformaldeído a 2% em cada poço e incube em gelo coberto com papel alumínio por 30 min.
- Durante os últimos 5 minutos, adicione 4 μL de corante de ácido nucleico fluorescente vermelho distante 0,2 mM para rotular os núcleos. 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ou outros corantes também podem ser usados para marcar o DNA.
- Lave as células três vezes com 1 mL de PBS frio e monte as lamínulas nas lâminas do microscópio usando um meio de montagem antidesbotamento de 7 μL. Deixe o meio de montagem endurecer durante a noite antes de selar a lamínula na lâmina do microscópio usando esmalte
.
- Imagem dos macrófagos por microscopia confocal. Ex/Em para FAM-YVAD-FMK é 492/520nm e 642/661 para coloração de ácido nucleico fluorescente vermelho-distante. Certifique-se de configurar o microscópio de forma que as células não tratadas não apresentem nenhuma coloração de fundo no canal 488. Caso contrário, a coloração FAM-YVAD-FMK de fundo será detectada e não a caspase-1 ativa real.
5. Imagem de macrófagos marcados por microscopia confocal
NOTA: As células coradas podem ser visualizadas depois que as lamínulas curarem durante a noite e forem seladas à lâmina do microscópio com esmalte. Aqui, a imagem usando um microscópio confocal é descrita. As células também podem ser visualizadas por microscopia de fluorescência padrão.
- Coloque a lâmina com as células de controle não tratadas no microscópio stage e focalize o microscópio nas células.
- Usando as configurações da tabela de pesquisa do microscópio (LUT), ajuste o deslocamento de forma que não haja coloração FAM-YVAD-FMK positiva nas células não tratadas. Esse processo também pode ser realizado com macrófagos deficientes em caspase-1.
nota: O deslocamento deve ser ajustado para cada canal usado no experimento, mas definir o deslocamento correto é mais crítico para o canal FAM-YVAD-FMK e os canais de anticorpos fluorescentes. O deslocamento para o canal de DNA é menos crítico. Depois que o deslocamento for definido, não ajuste essa configuração para o restante do experimento.
- Mude o slide para a amostra tratada com nigericina. Encontre um campo que contenha células positivas e negativas para a coloração FAM-YVAD-FMK. Ajuste o plano de imagem do canal FAM-YVAD-FMK para o plano que tem a maior intensidade de coloração positiva. Este normalmente será o plano onde o centro do foco do inflamassoma é visualizado.
- Ajuste o ganho de forma que os focos sejam visíveis nas células que possuem núcleos condensados. Depois de definir o ganho e o deslocamento, deixe essas configurações para o restante da sessão de imagem.
nota: Uma maneira fácil de determinar se uma célula é piroptótica é observando a morfologia nuclear. As células com caspase-1 ativa têm núcleos arredondados e condensados, enquanto os nucléolos são visíveis em células sem ativação da caspase-1 e a morfologia nuclear é semelhante à das células não tratadas.
- Colete imagens de 5 campos selecionados aleatoriamente com ampliação total de 100X. Isso normalmente resultará em cerca de 40 células por imagem. Repita esse processo para cada amostra.
- Conte o número de células em cada imagem usando o software de análise de imagem. Em seguida, conte o número de células que têm coloração FAM-YVAD-FMK positiva. Represente o nível de ativação da caspase-1 como a porcentagem de células positivas para FAM-YVAD-FMK.
