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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Diferenciação de macrófagos derivados da medula óssea
- Usando meio de diferenciação pré-aquecido (21 mL de DMEM-10 completo e 9 mL de meio condicionado por células L929, conforme descrito por Swanson et al.), coloque as células da medula óssea em uma placa de Petri não tratada com cultura de tecidos de 15 cm (1,2-1,5 x 107 células). Incubar a placa a 37 °C e 5% de CO2 durante 7 dias. Adicione mais 30 mL de meio de diferenciação à placa no dia 3 ou 4.
nota: É importante não usar placas tratadas com cultura de tecidos, pois os macrófagos serão difíceis de desprender e colher.
- Para coletar macrófagos, lave a placa com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adicione 20 mL de PBS frio + 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Incubar a placa a 4 °C durante 10 min. Colha as células pipetando o PBS + EDTA sobre as células e lavando a placa com 10 mL de PBS. Combine as duas lavagens em dois tubos cônicos de 15 mL.
- Centrifugue as células a 300 x g por 10 min e ressuspenda as células em 10 mL de DMEM livre de vermelho de fenol + 5 mM HEPES + 0,2 mg / mL de L-glutamina + 0,05 mM de 2-mercaptoetanol + 5% FBS (DMEM-5) e conte as células usando um hemocitômetro ou um contador de Coulter. Mantenha as células congeladas durante a contagem.
- Semeie os macrófagos em placas revestidas com cultura de tecidos a 2 x 105 células / mL. Para experimentos de microscopia, semeie 1 mL de células em lamínulas em placas de 24 poços. Para ensaios de liberação de LDH, semeie 100 μL de células em uma placa de 96 poços. Para o ensaio de LDH, semear 9 poços (3 poços não tratados, 3 poços com 100% de controles de lise e 3 poços para o estímulo experimental).
- Centrifugue a placa de 96 poços por 5 min a 300 x g para garantir que as células estejam igualmente distribuídas pelo poço.
- Incubar a placa durante a noite a 37 °C + 5% de CO2 antes de iniciar o processo de preparação.
2. Preparação
- Substitua o meio por meio fresco (DMEM-5) contendo 100 ng/mL de LPS (500 μL para a placa de 24 poços ou 50 μL para a placa de 96 poços).
nota: Há uma variedade de variações estruturais no LPS, que afetam a capacidade de estimular o priming mediado por TLR4. O LPS de Salmonella minnesota R595 (Re) está disponível em vários fornecedores e é recomendado.
- Incubar a placa durante 3 h a 37 °C e 5% de CO2.
3. Ativação do Inflamassoma NLRP3 com Nigericina
- Remova o meio e substitua-o por 290 μL de DMEM-5 contendo 5 μM de nigericina e 5 mM de glicina. A glicina é adicionada para reduzir a quantidade de lise celular que ocorre durante a ativação da caspase-1. Incubar durante 60 min a 37 °C e 5% de CO2. Use macrófagos do tipo selvagem e deficientes em caspase-1 para garantir que a marcação observada seja específica para a caspase-1.
- Após 60 min, remova o meio e lave as células três vezes por 5 min cada com 1 mL de PBS frio.
4. Coloração de anticorpos
NOTA: Para rotular as células com anticorpos para detectar ASC, semeie, prepare e exponha as células à nigericina idênticas à seção anterior. O processamento posterior é o seguinte:
- Lave as células três vezes por 5 minutos cada com 1 mL de PBS frio. Adicione 250 μL de solução de fixação e permeabilização. Incube as células no gelo e cubra por 30 min.
- Lave os macrófagos três vezes por 5 minutos cada com 1 mL de tampão de lavagem.
- Adicione 250 μL de anticorpo primário contra ASC diluído 1:500 em tampão de lavagem e incube por 1 h em gelo. Inclua uma lamínula que não receba nenhum anticorpo primário, mas receberá apenas o secundário. Esta lamínula será usada durante a configuração do microscópio para definir o deslocamento correto.
- Lave as células três vezes por 5 min cada com 1 mL de tampão de lavagem.
- Adicione 250 μL de anticorpo secundário (corante fluorescente conjugado cabra-anti-camundongo) diluído 1:500 em tampão de lavagem e incube por 1 h em gelo. Adicione 4 μL de corante de ácido nucleico fluorescente vermelho distante de 0,2 mM nos últimos 5 minutos desta incubação para rotular os núcleos.
- Lave as células 3x com 1 mL de tampão de lavagem a frio e monte as lamínulas nas lâminas do microscópio usando um meio de montagem antidesbotamento de 7 μL. Deixe o meio de montagem endurecer durante a noite antes de selar a lamínula na lâmina do microscópio usando esmalte transparente.
- Imagem de macrófagos por microscopia confocal. Ex/Em para o anticorpo secundário é 555/580 nm e 642/661 para a coloração de ácido nucleico fluorescente vermelho-distante.