Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase para detectar a morte de macrófagos após a exposição à nigericina

Resumo

Fonte: den Hartigh, A.B. et al., Detecção de ativação do inflamassoma e morte celular piroptótica em macrófagos derivados da medula óssea murina. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o ensaio de lactato desidrogenase para detectar a morte de macrófagos mediada por inflamassoma. Os macrófagos são expostos ao lipopolissacarídeo para priming, seguido pela exposição à nigericina para causar a morte celular induzida pelo inflamassoma, que é determinada pelo ensaio de lactato desidrogenase.

Protocolo

1. Ensaio de liberação de LDH

NOTA: Para o ensaio de liberação de LDH, semeie as células em uma placa de 96 poços. Não remova o meio após o primer.

1. Substitua o meio por meio fresco (DMEM-5: 10 mL de DMEM livre de vermelho de fenol + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM de 2-mercaptoetanol + 5% de FBS) contendo 100 ng/mL de LPS em poços contendo células de macrófagos aderentes (500 μL para as placas de 24 poços ou 50 μL para as placas de 96 poços).
   nota: Há uma variedade de variações estruturais no LPS, que afetam a capacidade de estimular o priming mediado por TLR4. Recomenda-se LPS de Salmonella minnesota R595 (Re).
2. Incubar a placa durante 3 h a 37 °C e 5% de CO₂.
3. Adicione 50 μL de DMEM-5 contendo 10 μM de nigericina aos poços experimentais e 50 μL de DMEM-5 aos poços de controle espontâneo e 100% de lise. Incubar durante 60 min a 37 °C e 5% de CO₂.
4. Após 30 min, adicione 10 μL de tampão de lise 10x aos poços de controle de lise 100% e adicione 10 μL de DMEM-5 aos outros poços. Durante esta incubação, remova 1 frasco de mistura de substrato (1,5 mL de substrato liofilizado) e 1 alíquota de tampão de ensaio (~12 mL) do freezer e deixe-os descongelar protegidos da luz à temperatura ambiente.
   nota: A mistura de substrato contém um sal de tetrazólio (iodonitrotetrazolium violet), que é convertido em um produto de formazan vermelho.
5. Após 60 min de incubação total, centrifugue a placa durante 5 min a 500 x g a 10 °C. Transferir 50 μL do sobrenadante para uma placa de fundo plano transparente. Durante este tempo, adicione 12 mL de tampão de ensaio ao frasco para injetáveis da mistura de substrato e incube à temperatura ambiente durante 5 min antes de utilizar.
6. Adicione 50 μL de substrato a cada poço e incube por 30 min no escuro. Inclua poços somente médios para valores em branco. Verifique a placa após 15 minutos para certificar-se de que o sinal não excederá o limite de detecção do leitor de placas.
7. Após 30 min, adicione 50 μL de solução de parada (ácido acético 1 M) e meça OD₄₉₀ usando um leitor de placas.
8. Calcule a porcentagem de lise celular usando a seguinte fórmula:
   % Citotoxicidade = ((Experimental - Espontâneo)/(Máximo - Espontâneo))×100
   Experimental: células tratadas com nigericina; espontâneo: células não tratadas; máximo: células expostas ao tampão de lise.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cytotox96 Ensaio de citotoxicidade não radioativa	Fisher Científico	Informações do modelo: PR-G1780	Inclui mistura de substrato e tampão de ensaio; Formulações proprietárias. A solução de parada é 1 M Ácido acético
DMEM, glicose alta, sem glutamina, sem vermelho de fenol	Invitrogen	31053028
PBS de Dulbecco, sem cálcio, sem magnésio	Invitrogen	14190144
Soro fetal bovino, qualificado, origem americana	Invitrogen	26140079	Inativado por calor a 55 ° C por 50 min
gentamicina	Invitrogen	15750060
LPS ultrapuro de Salmonella minnesota R595 (Re)	Lista de produtos biológicos	434
Leitor de placas Spectramax M3	Dispositivos Moleculares	5000414
L-Glutamina	Invitrogen	21051024