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Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Isolamento de neutrófilos saudáveis
- Obtenha 20 mL de sangue periférico de um doador saudável em dois tubos revestidos com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) de 10 mL.
- Coloque 10 mL de sangue em um tubo estéril de 50 mL e adicione solução salina tamponada com fosfato (PBS) até 32,5 mL.
- Adicione gradiente de densidade (por exemplo, Ficoll-amidotrizoaat) sob as células.
- Pegue 14 mL de gradiente de densidade com uma pipeta de 10 mL e um controlador de pipeta.
- Coloque a pipeta no fundo do tubo de 50 mL.
- Retire o controlador da pipeta da pipeta, permitindo que o gradiente de densidade flua para fora da pipeta por gravidade até que o máximo seja atingido por efeito capilar (restará 1-2 mL), sem usar o motor.
- Remova a pipeta colocando um polegar em cima da pipeta, evitando assim que o gradiente de densidade vaze durante a remoção da pipeta.
- Gire os tubos por 20 min a 912 x g e temperatura ambiente (RT) sem aceleração ou freio.
NOTA: Os glóbulos vermelhos (RBC) e neutrófilos têm alta densidade e estão no fundo do tubo de 50 mL. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são separadas e no topo do gradiente de densidade como um anel branco. O plasma diluído em PBS estará acima dos PBMCs. Se necessário, os PBMCs podem ser isolados transferindo o anel branco para um novo tubo de 50 mL com etapas de lavagem adicionais com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Remova cuidadosamente o anel branco contendo PBMCs primeiro, seguido pela remoção do plasma diluído em PBS e, por último, a camada de gradiente de densidade, tanto quanto possível.
- Para isolar os neutrófilos da mistura neutrófilos / eritrócitos, lise os eritrócitos com água destilada estéril fria.
- Pegue uma garrafa de água destilada estéril fria e um frasco de PBS concentrado 10x da geladeira.
- Trabalhe rapidamente para esta etapa. Adicione 36 mL de água destilada estéril fria diretamente em cima do pellet e misture uma vez com cuidado. Adicione 4 mL de PBS 10x após 20 s para fazer uma solução isotônica. Misture uma vez com cuidado.
- Girar o tubo durante 5 min a 739 x g e a 4 °C (para a remoção das hemácias). Os neutrófilos estarão no pellet branco.
- Descarte cuidadosamente o sobrenadante. Execute a etapa 1.6.2 novamente e certifique-se de que o pellet esteja suspenso corretamente.
- Gire o tubo por 5 min a 328 x g e 4 °C.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 5 mL de PBS. Conte os neutrófilos e mantenha-os no gelo.
NOTA: O rendimento esperado de 1 tubo de sangue (10 mL) é de aproximadamente 15-75 milhões de neutrófilos.
2. Marcação de neutrófilos em células fluorescentes vermelhas
- Faça uma suspensão de neutrófilos de 10-20 milhões de neutrófilos em 2 mL de PBS em um tubo de 15 mL.
- Faça uma solução de 2 mL de PBS com 4 μL de ligante de células fluorescentes vermelhas de 2 μM (consulte a Tabela de Materiais) em um tubo diferente de 15 mL. Adicione suavemente à suspensão de neutrófilos e misture cuidadosamente.
- Incubar no escuro durante exactamente 25 min a 37 °C para marcar os neutrófilos com o ligante de células fluorescente vermelho.
- Inative a rotulagem adicionando meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contendo 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) em RT até 15 mL e misture uma vez com cuidado. Certifique-se de que o pellet seja cuidadosamente ressuspenso se um pellet se formou.
- Gire o tubo por 5 min a 328 x g e RT.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 5 mL de meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol contendo 2% de FBS e 10% de penicilina/estreptomicina (P/S) em RT. Conte os neutrófilos.
nota: Uma perda de células de 50% pode ocorrer após a marcação de células fluorescentes vermelhas.
3. Indução da formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos
- Faça uma suspensão celular de 0,42 x 106 células/mL em meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol contendo 2% de FBS e 10% de P/S.
- Adicione 37.500 neutrófilos em 90 μL por poço em uma placa preta de fundo plano de 96 poços.
- Adicione 10 μL do estímulo escolhido (por exemplo, soros de um paciente) em triplicata para atingir uma concentração de 10% no poço. Incluir sempre um controlo negativo (médio) em triplicado.
- Incubar no escuro a 37 °C pelo tempo desejado, variando de 30 min a 2, 4 ou 6 h. Sugere-se incubar por 4 horas.
- Calcule o volume necessário para adicionar 25 μL de corante de DNA impermeável a 5 μM (ver Tabela de Materiais), para atingir uma concentração final de 1 μM no poço. Fazer uma pré-diluição, se necessário, em meio RPMI 1640 contendo 2% de FBS e 10% de P/S para obter uma concentração de 5 μM.
- Adicione 25 μL de corante de DNA impermeável 5 μM 15 minutos antes do final do tempo de incubação. Continue a incubação por mais 15 minutos a 37 ° C no escuro.
- Remova o sobrenadante (~ 125 μL) com muito cuidado e guarde-o, se necessário. Adicione 100 μL de paraformaldeído a 4% (PFA). Mantenha-se no escuro e continue imediatamente com a etapa 4.
4. Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NET) com microscopia confocal de imunofluorescência 3D de alto conteúdo e alta resolução
- Defina as configurações no microscópio confocal de imunofluorescência clicando na configuração de aquisição.
- Clique na guia Configurar.
- Selecione a objetiva e a câmera. Escolha a objetiva Apo Lambda 10X com um modo de aquisição de um orifício confocal de 60 μm.
- Clique em Placa e escolha a placa de plástico de 96 poços. Selecione os sites a serem visitados e escolha um número fixo de sites. Preencha 3 colunas e 3 linhas sem sobreposição (0 μm), que cobrem um total de 45% do poço.
- Clique em Aquisição. Selecione Ativar foco baseado em laser. Selecione Adquirir Série Z/Série Temporal, se necessário.
- Clique em Foco automático do site.
- Clique em Foco na parte inferior da placa | Deslocado por espessura inferior. Para o poço inicial encontrar a amostra, escolha o primeiro poço adquirido. Para o foco automático do site, escolha todos os sites.
- Clique em Comprimentos de onda.
- Para o número de comprimentos de onda, escolha 2. Para o nível de refinamento de correção de sombreamento TL, escolha 2.
- Para Wavelength 1, selecione Texas Red.
- Para as opções de foco automático, selecione laser com deslocamento Z, pós-deslocamento do laser de 1.1 μm. Use a pilha Z com uma faixa personalizada de 200-10.
- Para o comprimento de onda 2, selecione isotiocianato de fluoresceína (FITC).
- Para as opções de foco automático, selecione laser com deslocamento Z de w1 0 μm. Use a pilha Z com um intervalo personalizado de 200-10.
- Para as opções de aquisição, selecione Série Z e imagem de projeção 2D máxima. Para as opções de aquisição, selecione Correção de sombreamento | Desligado.
- Selecione Série Z. Selecione o número de etapas: 10. Selecione o tamanho do passo: 3 μm (o intervalo total será de 27 μm).
- Coloque a placa na microscopia confocal de imunofluorescência.
- Clique na guia Executar.
- Preencha o nome e a descrição da placa e escolha o local de armazenamento.
- Selecione os poços que precisam ser adquiridos.
- Escolha o tempo de exposição para Texas Red e FITC.
- Clique em Adquirir Placa para iniciar a aquisição, que levará aproximadamente 1 h por placa.
5. Análise da Formação NET
- Use um programa de processamento de imagem projetado para a análise de imagens científicas multidimensionais (consulte a Tabela de Materiais) para analisar a formação de NET.
- Transfira os dados de imagem adquiridos para um disco rígido separado.
- Selecione a ferramenta de adição de cores.
- Selecione w1 e escolha a pasta no disco rígido onde os dados estão armazenados.
- Selecione w2 e escolha a pasta no disco rígido onde os dados estão armazenados.
nota: Use uma macro padrão que use w1 no nome do arquivo para adicionar cor vermelha às imagens Texas Red e use w2 para adicionar cor verde às imagens FITC.
- Selecione Macro de análise.
- Selecione w1 e escolha o valor limite (limite de intensidade), que geralmente é 10. Selecione o valor de pixel desejado (limite de tamanho, por exemplo, 100).
- Selecione w2 e escolha o valor limite (limite de intensidade), que geralmente é 10. Selecione o valor de pixel desejado (limite de tamanho, por exemplo, 500).
- Escolha o destino do arquivo de planilha, execute a análise e salve os arquivos de log posteriormente.
- Analise dados em uma planilha.