Isolamento de lipídios de neutrófilos derivados do sangue humano por separação bifásica

Resumo

Fonte: Brogden, G., et al. Métodos para estudar alterações lipídicas em neutrófilos e a subsequente formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o isolamento lipídico de neutrófilos humanos por um sistema de solvente bifásico usando metanol e clorofórmio.

Protocolo

1. Isolamento lipídico e análise de neutrófilos derivados do sangue humano

1. Pegue os neutrófilos e coloque-os no gelo.
2. No gelo, pipete os neutrófilos (presentes na solução de metanol e clorofórmio) para um tubo de vidro com tampa de rosca de 15 mL com vedação de politetrafluoretileno (PTFE) e homogeneize-os agitando por 1 min. Use tubos de vidro para evitar que os lipídios se liguem às superfícies plásticas. Use tampas de PTFE para evitar a contaminação por borracha/plástico.
3. Adicione 2 mL de metanol seguido 1 minuto depois por 1 mL de clorofórmio. Agite novamente por 1 min.
4. Gire os tubos de vidro em RT e 50 rpm por 30 min.
5. Granular a fracção proteica centrifugando a solução a 7 °C e 1,952 x g durante 10 min.
6. Transvasar cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de vidro com tampa de rosca de 15 ml, deixando para trás o sedimento que contém proteínas. Conservar o pellet a -20 °C para posterior quantificação.
7. Adicione 1 mL de clorofórmio, aguarde 1 min, adicione 1 mL de água bidestilada e inverta o tubo de tampa de rosca de vidro com a amostra por 30 s.
8. Centrifugar a 7 °C e 1,952 x g durante 10 min e rejeitar a fase superior, até à camada turva, mas não incluindo.
9. Se necessário, execute uma etapa de purificação adicional opcional repetindo a etapa 1.1.8.
10. Secar as amostras num concentrador de vácuo a 60 °C e armazená-las a -20 °C até serem necessárias.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 10 μl	Hamilton	701 NR 10 μl
Cânula 26G	Braun	4657683
clorofórmio	Carl Roth	7331.1
metanol	Carl Roth	7342.1
Água	Carl Roth	3255.1	Livre de endotoxinas