Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase para detectar a infecção por Cryptococcus neoformans em macrófagos

Resumo

Fonte: Ball, B., et al. Fluxo de trabalho proteômico quantitativo sem rótulo para interações hospedeiro-patógeno orientadas por descoberta. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de citotoxicidade para avaliar a infecção por Cryptococcus neoformans, um fungo patogênico, em macrófagos. A citotoxicidade é determinada pela liberação da enzima lactato desidrogenase citoplasmática devido à lise de macrófagos causada pela infecção por Cryptococcus neoformans.

Protocolo

1. Verificação da infecção

NOTA: Usando um ensaio de citotoxicidade, a proficiência em infecção pode ser medida. O protocolo a seguir destacará a aplicação de um produto de citotoxicidade para medir a liberação de LDH (lactato desidrogenase). Outros produtos de citotoxicidade também podem ser usados

1. Preparação da infecção por C. neoformans de células de macrófagos
   1. Preparação de células fúngicas
      1. Usando um estoque de glicerol, listre a cepa C. neoformans do tipo selvagem (H99) em uma placa de ágar peptona dextrose (YPD) de extrato de levedura para isolar colônias individuais.
      2. Incubar durante a noite durante 16 h a 37 °C numa incubadora estática.
      3. Selecione uma única colônia de cepa e cultura de C. neoformans de tipo selvagem em 5 mL de caldo YPD em um tubo de ensaio de 10 mL com tampa solta. Execute em quadruplicado.
      4. Incubar durante a noite durante 16 h a 37 °C numa incubadora agitada a 200 rpm.
      5. No dia seguinte, subcultive cada cultura durante a noite em uma diluição de 1:100 em 3 mL de caldo YPD.
      6. Meça os valores de densidade óptica (OD_600nm) da cultura fúngica para determinar a fase intermediária. Dependendo do espectrofotômetro, a cepa selvagem de C. neoformans atinge a fase intermediária geralmente após 6 a 8 h de incubação em YPD com valores gerais de OD_600nm variando de 1,0 a 1,5.
      7. Quando as células atingirem a fase intermediária, pegue uma alíquota de 10 μL de suspensão de células fúngicas em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL e dilua 1:100 em solução salina estéril 1x tamponada com fosfato (PBS). Conte o número de células usando um hemocitômetro.
      8. Colete e centrifugue as células a 1.500 x g por 10 min, lave suavemente o pellet com PBS estéril em temperatura ambiente e repita por um total de três lavagens.
      9. Ressuspenda as células em um meio de cultura de células livre de antibióticos para atingir uma concentração de 1,2 x 10⁸ células / mL.
   2. Preparação de células de macrófagos
      1. Visualize cada poço na placa de 6 poços para garantir que as células tenham atingido 70-80% de confluência. Alternativamente, as células podem ser medidas para atingir aprox. 1,2 x 10⁶ células de macrófagos por poço.
      2. Meio quente suplementado com antibióticos a 37 °C antes do trabalho de cultura celular. Certifique-se de que o ambiente de trabalho seja esterilizado antes do trabalho de cultura de células. Visualize as células usando um microscópio de luz para garantir que as células estejam aderentes e saudáveis.
      3. Retirar o meio de cultura celular da cápsula com uma pipeta serológica ou com um aspirador a vácuo.
      4. Adicione suavemente 5-7 mL de PBS estéril à temperatura ambiente (solução salina tamponada com fosfato) ao prato de 60 x 15 mm.
      5. Incline suavemente o prato para lavar as células aderidas.
   3. Co-cultura de C. neoformans e células de macrófagos
      1. Adicione 1 mL das células de C. neoformans ressuspensas a 4 poços contendo células de macrófagos.
         nota: O número de placas necessárias precisará ser calculado antes de iniciar o experimento. Adicione 1 mL de meio livre de antibióticos aos poços vazios.
      2. Deixar as células incubarem a 37 °C com 5% de CO₂ durante 3 h.
      3. Remover o meio de cultura celular da placa com uma pipeta serológica ou com um aspirador a vácuo.
      4. Adicione suavemente 1 mL de PBS estéril em temperatura ambiente.
      5. Incline suavemente a placa para lavar as células extracelulares de C. neoformans não aderidas ou não fagocitadas.
      6. Adicione 1 mL de meio livre de antibióticos a cada poço na placa de 6 poços.
      7. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂.
   4. Em pontos de tempo selecionados (por exemplo, 1, 3, 6, 12 e 24 horas), colete o sobrenadante para medição da liberação de LDH de acordo com as instruções do fabricante.
   5. Ao mesmo tempo, as células de macrófagos não infectadas serão lisadas até um determinado valor para máxima citotoxicidade.
   6. Calcule a citotoxicidade da seguinte forma:
      

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100 mM Tris-HCl, pH 8,5	Fisher Científico	BP152-1	Manter a 4°C
Prato de 60 x 15 mm, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	174888
Placa de cultura de células de 6 poços	ThermoFisher Scientific	140675
Tubos cônicos de falcão (15 mL)	Fisher Científico	05-539-12
Contador de Células Automatizado Countess II	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Não é essencial, o hemocitômetro pode ser usado como alternativa.
CytoTox 96 Ensaio de citotoxicidade não radioativa	Promega	G1780
DMEM, glicose alta, suplemento de GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	10566016
Soro fetal bovino (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Inativar o calor incubando a 60 ° C por 30 minutos. Preparar alíquotas de 50 ml e congelar rapidamente. Descongelar antes da preparação do meio
Hemocitômetro	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Prepare 40 mM HEPES / 8 M Ureia em solução estoque a granel, congelada rapidamente, armazene a -20 ° C até o uso. Descarte após cada uso (não congele e descongele repetidamente).
L-glutamina	ThermoFisher Scientific	25030081	Pode ser alíquota e congelado para armazenamento. Descongele antes da preparação da mídia.
Microcentrífuga	Eppendorf	13864457
Penicilina : Estreptomicina 10k/10k	VWR	CA12001-692	Pode ser alíquota e congelado para armazenamento. Descongele antes da preparação da mídia.
Solução salina tamponada com fosfato	VWR	CA12001-676	Compra não necessária. O PBS também pode ser preparado, mas a filtragem estéril deve ser realizada antes do uso.
Pipeta Sorológica Descartável (10 mL)	Fisher Científico	13-678-11E
Pipeta Sorológica Descartável (25 mL) Basix	Fisher Científico	14955235
Mistura de protease de tripsina / Lys-C, grau MS	furar	Rolamento A40007	Manter a -20 °C.
ureia	Sigma Aldrich	U1250-1KG	Preparar HEPES/8 M de ureia 40 mM em solução a granel, congeladas rapidamente, conservar a -20 °C até à utilização. Descarte após cada uso (não congele e descongele repetidamente).
Caldo de dextrose peptona de extrato de levedura	BD Difco	BM20