Um sistema de infecção baseado em inserção de membrana permeável para estudar o impacto de toxinas bacterianas

Abstract

Fonte: Flaherty, R. A., et al. Implementação de um sistema de infecção baseado em inserção de membrana permeável para estudar os efeitos de toxinas bacterianas secretadas em células hospedeiras de mamíferos. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra um sistema de infecção baseado em inserção de membrana permeável para avaliar o impacto das toxinas bacterianas secretadas. Ao eliminar o contato direto entre o patógeno bacteriano e as células hospedeiras usando uma membrana permeável, essa técnica permite estudar o efeito das toxinas secretadas por bactérias patogênicas nas células hospedeiras de mamíferos.

Protocol

1. Cultura bacteriana

1. Gerar cepas mutantes isogênicas a serem utilizadas para o estudo do fator de interesse secretado específico.
   nota: As cepas GAS (Streptococcus do Grupo A) M1T1 5448 utilizadas para esses experimentos incluíram WT (tipo selvagem) GAS ', um gato sagAΔdeficiente em SLS (sag = gene associado à estreptolisina S, SLS = estreptolisina S) mutante (abreviado no texto como ΔsagA) e uma cepa complementada por sagA (abreviada no texto como ΔsagA + sagA).
2. Preparar culturas líquidas durante a noite de estirpes bacterianas de interesse. Cultivar estirpes de GAS M1T1 5448 em 10 ml de caldo Todd-Hewitt a 37 °C durante 16-20 horas antes de infectar as células humanas.
3. Centrifugue culturas bacterianas durante a noite (2.400 rcf por 10 min) e ressuspenda em meio bacteriano fresco.
   nota: A ressuspensão no mesmo volume em que as culturas noturnas foram cultivadas (5-10 ml) geralmente produz uma densidade óptica inicial desejável.
4. Normalizar as culturas bacterianas para concentrações iniciais iguais, diluindo as culturas ressuspensas em meio bacteriano adicional até obter a mesma densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) para todas as estirpes a ensaiar (recomenda-se OD₆₀₀ de aproximadamente 1,0 por conveniência).
   nota: Nesses estudos, culturas bacterianas em fase estacionária foram usadas para infectar as células hospedeiras imediatamente após a normalização. No entanto, como algumas cepas de bactérias saem da fase estacionária de forma não síncrona, pode ser mais apropriado iniciar as infecções do hospedeiro com culturas de fase logarítmica, se esse for o caso das cepas de interesse.
5. Antes de uma análise mais aprofundada, realize um ensaio de contagem de colônias para determinar as unidades formadoras de colônias (UFC) por mililitro presentes nas culturas iniciais, de modo que a multiplicidade de infecção (MOI), ou proporção de bactérias por célula hospedeira, possa ser determinada.
   1. Prepare diluições seriadas de 1 ml de culturas bacterianas que foram normalizadas para a densidade óptica desejada em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou meio de crescimento bacteriano apropriado (o caldo Todd-Hewitt foi usado nesses estudos). Prepare diluições variando de ^10-1 a ^10-6 para produzir pelo menos um conjunto de placas de ágar com colônias contáveis (30-300 colônias). Efectuar todas as diluições em triplicado.
   2. Transferir 100 μl de cada diluição seriada para uma placa de ágar contendo o meio apropriado para a espécie bacteriana a ser analisada.
      nota: O ágar Todd-Hewitt foi usado nesses estudos.
   3. Use um espalhador bacteriano de vidro ou plástico para distribuir uniformemente a alíquota de 100 μl por toda a superfície da placa de ágar e continue espalhando até que o líquido seja absorvido pelo ágar. Execute sob chama usando uma técnica estéril.
   4. Incubar as placas de ágar-ágar a 37 °C durante a noite ou até aparecerem colónias contáveis.
   5. Contar as colónias que crescem em cada placa e calcular o UFC/ml na cultura original através da seguinte fórmula: número de colónias x inverso da diluição em série/volume de cultura plaqueado em mililitros.
      por exemplo, (200 colônias x 1/^10-5 diluição) / 0,1 ml em placas = 2,0 x 10⁸ UFC/ml.

2. Cultura de células hospedeiras

1. Obtenha uma linhagem de células hospedeiras apropriada para as análises desejadas.
   nota: Os queratinócitos epiteliais humanos HaCaT, um presente gentil de V. Nizet, foram usados para esses estudos.
   1. Manter células HaCaT em placas de cultura de 100 mm no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS). Incubar a 37 °C com 5% de CO₂.

3. Infecção da célula hospedeira com sistema de inserção de membrana permeável

1. Plaquear as células em placas apropriadas de cultura de tecidos e deixá-las crescer até atingirem 90% de confluência.
   nota: As células HaCaT usadas nesses estudos geralmente atingem a confluência dentro de 2-3 dias após o plaqueamento.
   1. Para a coleta de lisado (por exemplo, análise de sinalização e ensaios de determinação de trifosfato de adenosina (ATP)), coloque células HaCaT em placas de 6 poços com uma densidade de semeadura de aproximadamente 3 x 10⁵ células/poço.
   2. Para experimentos de imagem de imunofluorescência, células de placa em lamínulas de vidro estéril dentro de placas de 6 poços a uma densidade de semeadura de aproximadamente 3 x 10⁵ células/poço.
   3. Para ensaios de permeabilização da membrana do homodímero de etídio e liberação de lactato desidrogenase (LDH), coloque células HaCaT em placas de 24 poços a uma densidade de semeadura de aproximadamente 5 x 10⁴ células/poço.
2. Imediatamente antes do tratamento, lave as células com 1x PBS estéril.
3. Aplique meio de crescimento fresco nas células. Para as condições descritas aqui, aplique 2 ml de meio por alvéolo para placas de 6 poços ou 0,5 ml de meio por alvéolo para placas de 24 poços. Se tratamentos farmacológicos estiverem sendo testados, misture com meio fresco e aplique durante esta etapa.
   Nota: Alguns ensaios podem exigir meios alternativos. Por exemplo, como o vermelho de fenol e as altas concentrações séricas interferem no ensaio de liberação de LDH, o meio de águia modificado de Dulbecco sem vermelho de fenol (DMEM) suplementado com albumina de soro bovino (BSA) a 1% (p / v), 2 mM de L-glutamina e 1 mM de piruvato de sódio foi utilizado para esses experimentos.
4. Após a aplicação do meio fresco, coloque cuidadosamente uma inserção de membrana permeável estéril de 0,4 μm em cada poço. Execute esta etapa em uma capela de fluxo laminar e use uma pinça estéril para transferir a inserção da membrana permeável em cada poço.
5. Aplicar meio de cultura de células frescas na câmara superior de cada alvéolo de acordo com as instruções do fabricante. Para as condições descritas aqui, aplique 1 ml de meio por poço para placas de 6 poços ou 0,1 ml de meio por poço para placas de 24 poços.
6. Aplicar um volume adequado de culturas bacterianas normalizadas (ver secção 1) na câmara superior do sistema de inserção de membranas permeáveis. Use um meio bacteriano para tratamentos de controle não infectados. Para os resultados descritos aqui, adicione 25 μl das culturas normalizadas por câmara para placas de 24 poços e 100 μl das culturas por câmara para placas de 6 poços.
   Nota: Nestes estudos, o GAS do tipo selvagem ou mutante foi aplicado às células hospedeiras em um MOI de 10. O MOI foi calculado com base no número final de células eucarióticas (por exemplo, 2 x 10⁶ células/poço), de modo que 10 vezes mais bactérias foram adicionadas por célula hospedeira no início do período de infecção (por exemplo, 2 x 10⁷ UFC por poço). O MOI apropriado varia de acordo com as diferentes espécies bacterianas e com as análises de acompanhamento desejadas.
   nota: Além de usar meio bacteriano para controles não infectados, outros controles úteis para certas aplicações dessa técnica podem incluir bactérias mortas pelo calor ou meio bacteriano gasto para comparação.
7. Incubar as células infectadas a 37 °C com 5% de CO₂.

4. Coleta de amostras

1. Para coletar meio de cultura de células, lisados de células hospedeiras ou lamínulas de vidro com células intactas para análises de acompanhamento, comece removendo cuidadosamente a inserção da membrana permeável com uma pinça estéril.
2. Para avaliação das proteínas secretadas do hospedeiro:
   1. Recolher o meio da câmara inferior em tubos de 1,5 ml. Evite perturbar a monocamada durante a coleta.
   2. Centrifugue amostras a 14.000 rcf por 10 min a 4 °C para remover detritos celulares.
   3. Remover tudo, exceto 50 μl do sobrenadante, para um novo tubo de 1,5 ml e conservar a -20 °C ou utilizar imediatamente.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Caldo Todd-Hewitt	Acumédia	7161A	Use caldo apropriado para espécies bacterianas de interesse.
Bioespectrômetro	Eppendorf	Modelo básico	Qualquer espectrofotómetro UV-Vis é adequado.
Placas de Petri	Fisher Científico	FB0875713	Outras marcas são adequadas.
Ágar	sigma	A1296-1kg	Outras marcas são adequadas.
HaCaT queratinócitos epiteliais humanos			Presente do laboratório de Victor Nizet.
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)	Tecnologias da Vida	11995-073	Use meios apropriados para a linha celular de interesse.
Soro fetal bovino (FBS)	Biooeste	S162H	Use aditivos de mídia apropriados para a linha celular de interesse.
Placas de cultura de tecidos de 10 cm	Nunc	Rolamento 150350	Outras marcas são adequadas.
Placas de cultura de tecidos de 6 poços	CytoOne	CC7682-7506	Outras marcas são adequadas, mas precisam ser compatíveis com a pastilha Corning.
Placas de cultura de tecidos de 24 poços	CytoOne	CC7682-7524	Outras marcas são adequadas, mas precisam ser compatíveis com a pastilha Corning.
Lamínulas de vidro	Marca de pescador	12-541-B	Estes devem ser autoclavados antes de serem usados para revestimento celular.
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	10010-023
DMEM sem vermelho de fenol	Tecnologias da Vida	31053028	O meio sem vermelho de fenol é necessário apenas para o ensaio de liberação de LDH.
Albumina de soro bovino (BSA)	Fisher Científico	BP1600-100
L-glutamina	Gibco	25030149	Necessário apenas para suplementar o meio de cultura celular para o ensaio de liberação de LDH.
Piruvato de sódio	Gibco	BP356100	Necessário apenas para suplementar o meio de cultura celular para o ensaio de liberação de LDH.
Inserções Transwell de 0,4 μm revestidas com colágeno (6 poços)	Corning	3540
Inserções Transwell de 0,4 μm revestidas com colágeno (24 poços)	Corning	3595
fórceps	pescador	3120018	Estes devem ser esterilizados com etanol antes de manusear as inserções Transwell.
Raspadores de células	Marca de pescador	08-100-241	Estes são necessários apenas para a coleta de lisados celulares.