1. Cultura bacteriana
- Gerar cepas mutantes isogênicas a serem utilizadas para o estudo do fator de interesse secretado específico.
nota: As GASM1T1 5448 cepas de Streptococcus utilizadas para esses experimentos incluíram WT GAS', um mutante deficiente em SLSde gato Δ sagA(abreviado no texto como ΔsagA) e uma cepa complementada sagA (abreviada no texto como ΔsagA + sagA).
- Prepare culturas líquidas durante a noite de cepas bacterianas de interesse. Cultive as cepas GAS M1T1 5448 em -10 ml de caldo Todd-Hewitt a 37 ° C por 16-20 horas antes de infectar células humanas.
- Centrifugue culturas bacterianas durante a noite (2.400 rcf por 10 min) e ressuspenda em meio bacteriano fresco.
nota: A ressuspensão no mesmo volume em que as culturas noturnas foram cultivadas (5-10 ml) geralmente produz uma densidade óptica inicial desejável.
- Normalizar as culturas bacterianas para concentrações iniciais iguais, diluindo as culturas ressuspensas em meio bacteriano adicional até que a mesma densidade óptica a 600 nm (OD600) seja obtida para todas as cepas a serem testadas (OD600 de aproximadamente 1,0 é recomendado por conveniência).
nota: Nesses estudos, culturas bacterianas em fase estacionária foram usadas para infectar as células hospedeiras imediatamente após a normalização. No entanto, como algumas cepas de bactérias saem da fase estacionária de forma não síncrona, pode ser mais apropriado iniciar as infecções do hospedeiro com culturas de fase logarítmica, se esse for o caso das cepas de interesse.
- Antes de uma análise mais aprofundada, realize um ensaio de contagem de colônias para determinar as unidades formadoras de colônias (UFC) por mililitro presentes nas culturas iniciais, de modo que a multiplicidade de infecção (MOI), ou proporção de bactérias por célula hospedeira, possa ser determinada.
- Prepare diluições seriadas de 1 ml de culturas bacterianas que foram normalizadas para a densidade óptica desejada em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou meio de crescimento bacteriano apropriado (o caldo Todd-Hewitt foi usado nesses estudos). Prepare diluições variando de 10-1 a 10-6 para produzir pelo menos um conjunto de placas de ágar com colônias contáveis (30-300 colônias). Efectuar todas as diluições em triplicado.
- Transferir 100 μl de cada diluição seriada para uma placa de ágar contendo o meio apropriado para a espécie bacteriana a ser analisada.
nota: O ágar Todd-Hewitt foi usado nesses estudos.
- Use um espalhador bacteriano de vidro ou plástico para distribuir uniformemente a alíquota de 100 μl por toda a superfície da placa de ágar e continue espalhando até que o líquido seja absorvido pelo ágar. Execute sob chama usando uma técnica estéril.
- Incubar as placas de ágar a 37°C durante a noite ou até que apareçam colónias contáveis.
- Contar as colónias que crescem em cada placa e calcular o UFC/ml na cultura original através da seguinte fórmula: número de colónias x inverso da diluição em série/volume de cultura plaqueado em mililitros.
por exemplo, (200 colônias x 1/10-5 diluição) / 0,1 ml em placas = 2,0 x 108 UFC/ml
2. Cultura de células hospedeiras
- Obtenha uma linhagem de células hospedeiras apropriada para as análises desejadas.
nota: Os queratinócitos epiteliais humanos HaCaT29, um presente gentil de V. Nizet, foram usados para esses estudos.
- Manter células HaCaT em placas de cultura de 100 mm no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS). Incubar a 37°C com 5% de CO2.
3. Infecção da célula hospedeira com sistema de inserção de membrana permeável
- Plaquear as células em placas apropriadas de cultura de tecidos e deixá-las crescer até atingirem 90% de confluência.
Nota: As células HaCaT usadas nesses estudos geralmente atingem a confluência dentro de 2-3 dias após o plaqueamento.
- Para a coleta de lisado (por exemplo, análise de sinalização e ensaios de determinação de trifosfato de adenosina (ATP)), coloque células HaCaT em placas de 6 poços com uma densidade de semeadura de aproximadamente 3 x 105 células/poço.
- Para experimentos de imagem de imunofluorescência, células de placa em lamínulas de vidro estéril dentro de placas de 6 poços a uma densidade de semeadura de aproximadamente 3 x 105 células/poço.
- Para ensaios de permeabilização da membrana do homodímero de etídio e liberação de lactato desidrogenase (LDH), coloque células HaCaT em placas de 24 poços a uma densidade de semeadura de aproximadamente 5 x 104 células/poço.
- Imediatamente antes do tratamento, lave as células com 1x PBS estéril.
- Aplique meio de crescimento fresco nas células. Para as condições descritas aqui, aplique 2 ml de meio por alvéolo para placas de 6 poços ou 0,5 ml de meio por alvéolo para placas de 24 poços. Se tratamentos farmacológicos estiverem sendo testados, misture com meio fresco e aplique durante esta etapa.
nota: Alguns ensaios podem exigir meios alternativos. Por exemplo, como o vermelho de fenol e as altas concentrações séricas interferem no ensaio de liberação de LDH, o DMEM sem vermelho de fenol suplementado com albumina de soro bovino (BSA) a 1% (p / v), 2 mM de L-glutamina e 1 mM de piruvato de sódio foi utilizado para esses experimentos.
- Após a aplicação do meio fresco, coloque cuidadosamente uma inserção de membrana permeável estéril de 0,4 μm em cada poço. Execute esta etapa em uma capela de fluxo laminar e use uma pinça estéril para transferir a inserção da membrana permeável em cada poço.
- Aplicar meio de cultura de células frescas na câmara superior de cada alvéolo de acordo com as instruções do fabricante. Para as condições descritas aqui, aplique 1 ml de meio por poço para placas de 6 poços ou 0,1 ml de meio por poço para placas de 24 poços.
- Aplicar um volume adequado de culturas bacterianas normalizadas (ver secção 1) na câmara superior do sistema de inserção de membranas permeáveis. Use um meio bacteriano para tratamentos de controle não infectados. Para os resultados descritos aqui, adicione 25 μl das culturas normalizadas por câmara para placas de 24 poços e 100 μl das culturas por câmara para placas de 6 poços.
Nota: Nestes estudos, o GAS do tipo selvagem ou mutante foi aplicado às células hospedeiras em um MOI de 10. O MOI foi calculado com base no número final de células eucarióticas (por exemplo, 2 x 106 células/poço), de modo que 10 vezes mais bactérias foram adicionadas por célula hospedeira no início do período de infecção (por exemplo, 2 x 107 UFC por poço). O MOI apropriado varia de acordo com as diferentes espécies bacterianas e com as análises de acompanhamento desejadas.
Nota: Além de usar meio bacteriano para controles não infectados, outros controles úteis para certas aplicações desta técnica podem incluir bactérias mortas pelo calor ou meio bacteriano gasto para comparação.
- Incubar as células infectadas a 37 °C com 5% de CO2.
4. Coleta de amostras
- Para coletar meio de cultura de células, lisados de células hospedeiras ou lamínulas de vidro com células intactas para análises de acompanhamento, comece removendo cuidadosamente a inserção da membrana permeável com uma pinça estéril.
- Para avaliação de lisados de células hospedeiras:
- Aspire suavemente o meio acima da monocamada das células hospedeiras. Evite perturbar a monocamada, pois isso pode resultar em sample perda.
- Enxágue as células uma vez com 1x PBS.
- Aspire suavemente o PBS. Aplique imediatamente um volume apropriado de tampão de lise gelada para atingir a concentração de proteína desejada e incube as amostras no gelo por 15 min. Aplicar entre 200 μl e 350 μl de tampão de lise por poço de cada placa de 6 poços para atingir concentrações de proteína entre 0,5 e 1,5 mg/ml.
Nota: O tampão de lise usado nesses estudos foi composto de água deionizada, 1% (v / v) de substituto Nonidet P40, um coquetel inibidor de fosfatase e um coquetel inibidor de protease. Reagentes específicos estão listados na seção Materiais e Equipamentos.
- Use um raspador de células para separar as células da superfície da placa de cada poço e pipetar todo o conteúdo de cada poço em um tubo de 1,5 ml.
- Centrifugue amostras a 14.000 rcf por 20 min a 4°C.
- Para avaliar os componentes do lisado solúvel, remova o sobrenadante para um tubo novo e armazene-o a -20 ° C ou use-o imediatamente.
- Para avaliar componentes nucleares ou outros componentes insolúveis do lisado, reserve o pellet e armazene-o a -20°C ou use-o imediatamente.
