Detecção de aderência bacteriana às células hospedeiras usando imagens de fluorescência

Resumo

Fonte: Yang, J., et al. Detecção automatizada e de alto rendimento da adesão bacteriana às células hospedeiras. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o ensaio de aderência bacteriana para avaliar a adesão bacteriana marcada com GFP à cultura de células epiteliais para estudar a dinâmica das interações patógeno-hospedeiro usando imagens baseadas em microscopia de fluorescência.

Protocolo

1. Adesão bacteriana e coloração de células hospedeiras

1. Primeiro, lave as monocamadas de células A549 semeadas três vezes com PBS 1x quente. Para cada lavagem, adicione 100 μL de 1x PBS a cada poço, pipete suavemente para cima e para baixo três vezes, descarte 1x PBS ou aguarde 10 s após a adição e, em seguida, aspire para remover 1x PBS. Para determinar a cinética da associação bacteriana, cubra as células com 100 μL das concentrações desejadas de suspensão bacteriana com diferentes MOIs (0, 1, 10 e 100). Gire as bactérias a 200 x g por 10 min e incube as células A549 infectadas a 37 ° C, 5% de CO₂ por mais 1 h.
   nota: Neste experimento, cada condição teve um triplicado técnico.
2. Remova as bactérias não ligadas lavando as monocamadas cinco vezes com 1x PBS quente, conforme descrito acima. Adicione 100 μL de formaldeído a 4% (em 1x PBS) em cada poço das placas de 96 poços para fixar as células. Deixe as placas descansarem no gelo por 15 min e, em seguida, lave a solução de fixação usando 1x PBS três vezes.
3. Para corar os núcleos, adicione 50 ng/mL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e incube por 10 min em RT. Após a incubação, lave os poços três vezes usando 1x PBS. Cubra as células A549 infectadas com 100 μL de 1x PBS para evitar o ressecamento. Processe para a próxima etapa ou armazene a placa a 4 °C por até 2 dias no escuro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10x PBS	VWR	Rolamento 45001-130
4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Thermo Fisher	Nº 62248	Corante de coloração de células hospedeiras
Placa de 96 poços	Corning	3882	Meia área bem, fundo plano e transparente
Células A549	ATCC	CCL 185	Linhagem celular de mamíferos
centrifuga	Eppendorf	5810R
OD600 Dilufotômetro	IMPLEN
Caldo de soja típico	Células de crescimento	MBPE-4040
F-12k médio	ATCC	302004	Meio de cultura celular A549
Soro fetal bovino	Corning	35-016-CV