Uma técnica de imagem para estudar a resposta do cálcio em células infectadas por bactérias

Resumo

Fonte: Smail, Y., et al. Imaging Ca²⁺ Respostas durante a infecção por Shigella de células epiteliais. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra uma técnica para detectar a resposta local e global do íon cálcio após a infecção por Shigella de células epiteliais humanas. A Shigella invade as células hospedeiras e libera efetores de invasão, impactando os níveis de cálcio intracelular. A amplitude e a frequência do cálcio citosólico local e global são estudadas usando um indicador fluorescente.

Protocolo

1. Preparativos

1. Preparação de bactérias
   1. Coloque as bactérias - cepa de Shigella do tipo selvagem que expressa a adesina AfaE (M90T-AfaE) - em uma placa de ágar tripticase soja (TCS) contendo 0,01% de vermelho Congo (CR) e incube-as por 18 h a 37 ° C.
      nota: Para aumentar sua reprodutibilidade, as placas de Shigella obtidas na etapa 1.1.1 são armazenadas a 4 ° C e devem ser usadas dentro de uma semana, pois todas as colônias em meio CR acabarão ficando vermelhas com o tempo.
   2. Inocule a pré-cultura do caldo TCS colhendo 3 colônias vermelhas das placas de estrias.
      nota: Uma inoculação com 3 colônias é realizada para limitar a probabilidade de escolher um único clone cujo plasmídeo de virulência tenha sofrido uma recombinação genética.
   3. Cultive culturas bacterianas líquidas em uma incubadora agitável por 16 h a 37 ° C a 200 rpm. Adicione ampicilina a uma concentração final de 75 mg / mL. As concentrações de antibióticos não devem exceder 3x a concentração inibitória mínima, pois um excesso de antibiótico pode levar à perda do plasmídeo de grande virulência.
      nota: A manutenção do plasmídeo de virulência de Shigella deve ser verificada por plaqueamento das culturas bacterianas em placas CR suplementadas com concentrações adequadas de antibióticos. A presença de colônias brancas indica perda de plasmídeo.
   4. Inocular a cultura de TCS com a pré-cultura bacteriana numa diluição de 1:100. Incubar a 37 °C numa incubadora agitável durante 2 h a 200 rpm. Certifique-se de que a densidade óptica a 600 nm (OD_600nm) seja de 0,2 a 0,4.
   5. Centrifugue a cultura bacteriana por 2 min a 13.000 x g a 21 ° C e ressuspenda o pellet em um volume equivalente de meio EM (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgCl₂, 5 mM de glicose e 25 mM HEPES, pH = 7,3).
   6. Diluir a suspensão bacteriana em um tampão EM a um OD_{final de 600 nm} de 0,1 e usá-lo imediatamente ou armazená-lo a 21 ° C e usá-lo nos próximos 60 minutos.
2. Preparação celular
   1. Cultive células HeLa em DMEM com 1 g/L de glicose suplementada com 10% de soro fetal de bezerro (FCS) e cultive-as a 37 °C com 10% de CO₂. Cultive TC-7 cultivado em DMEM com 4,5 g/L de glicose, contendo 10% de FCS e aminoácidos não essenciais em uma incubadora a 37 °C contendo 10% de CO₂.
   2. Para a manutenção celular, divida as células regularmente para evitar uma inibição do contato de crescimento ligada a estados confluentes; isso é crítico para uma alta eficiência de carregamento/transfecção da sonda de Ca²⁺.
   3. Colocar as células HeLa em lamínulas circulares estéreis de 25 mm de diâmetro em placas de 6 poços com uma densidade de 3 x 10,5 células/alvéolo no dia anterior à experiência para as células HeLa.
   4. Para células TC-7, tripsinize e conte as células. Semeá-los a 4 x 10⁵ células/poço e incubá-los por 5 a 7 dias a 37 °C em uma incubadora de CO_{10% 2} antes dos experimentos para permitir a polarização.
      1. Atualize o meio de cultura celular todos os dias até o dia do experimento.
         nota: Câmaras descartáveis com fundo de vidro de 35 mm de diâmetro também podem ser usadas como alternativa aos poços contendo lamínulas. Se estes últimos forem usados, o controle de temperatura através de um estágio ou objetiva aquecida não é suficiente, e é necessária uma câmara de incubação do termostato montada no estágio do microscópio.
3. No dia do experimento, remova o meio e lave as células 3x com 1 mL de meio EM a 21 °C.
4. Carregar as células com 3 mM de éster Fluo-4/acetoximetílico (Fluo-4-AM) num tampão EM durante 30 min a 21 °C.
   nota: Embora o carregamento de células HeLa subconfluentes não levante grandes problemas, o carregamento de células TC-7 polarizadas é frequentemente heterogêneo e pouco eficiente. Para essas células, descobrimos que a eficiência de carregamento é aprimorada pela adição do agente dispersante - ácido plurônico - a uma concentração final de 0,1% e do inibidor do transportador de ânions bromossulfoftaleína a uma concentração final de 20 μM ao EM contendo Fluo-4-AM. O uso de sondas químicas raciométricas ou sondas FRET geneticamente codificadas que requerem aquisição dupla não é compatível com a velocidade de aquisição necessária para a imagem de respostas locais de Ca²⁺.
5. Lave as amostras 3x com tampão EM e incube-as em 1 mL de tampão EM a 21 °C para permitir a hidrólise da porção AM. Use células carregadas com Fluo-4 imediatamente ou nos próximos 90 minutos (mantidas a 21 ° C).

2. Infecção e aquisição de imagens de respostas locais de Ca²⁺

1. Coloque a lamínula contendo as células carregadas com Fluo-4 em uma câmara de imagem ou câmara com fundo de vidro. Lave as amostras na câmara de imagem ou câmara descartável com fundo de vidro 3x com tampão EM para remover compostos potencialmente resultantes da lise celular. Adicione 1 mL de tampão EM.
2. Colocar a câmara numa platina de microscópio de fluorescência invertida aquecida a 33 °C.
   nota: Esta temperatura é selecionada como um compromisso entre as temperaturas ideais compatíveis com o processo de invasão de Shigella e a desaceleração das respostas de Ca²⁺ para visualizar as respostas locais. Usamos uma objetiva de óleo de imersão 63X (NA = 1,25) equipada com anéis de contraste de fase.
3. Selecione um campo de microscopia e configure os parâmetros de aquisição, incluindo tempo de exposição e binning, se necessário, para otimizar o sinal fluorescente Fluo-4.
   nota: Os principais desafios da imagem local de Ca²⁺ são a baixa amplitude e a pequena duração das respostas, exigindo aquisição pelo menos a cada 30 ms. Vários dispositivos acoplados de carga multiplicadora de elétrons retroiluminados (EM-CCD) ou câmeras semicondutoras de óxido metálico complementar (C-MOS) disponíveis comercialmente apresentam a sensibilidade necessária para detectar respostas locais de Ca²⁺ usando Fluo-4. A sensibilidade de detecção também é uma questão importante na limitação de fotodanos ou artefatos, como respostas espontâneas ligadas à excitação fluorescente do Fluo-4 em alta frequência. Aqui, uma iluminação baseada em LED de 470 nm, com um filtro de excitação passa-banda de 480 ± 40 nm, um filtro dicróico de 505 nm e uma emissão passa-banda de 527 ± 30 nm usada a 5% de sua intensidade máxima combinada com um filtro de densidade neutra de 1,0 foram usados para minimizar esses problemas em um fluxo de aquisições de durações limitadas. Uma análise dos sinais locais de Ca²+ por lotes de fluxos de 120 s foi realizada rotineiramente. Sob essas condições de baixa iluminação, o fotobranqueamento do fluoróforo não foi observado durante as aquisições de 2 min-stream. Aquisições sucessivas na mesma amostra podem ser realizadas, desde que sejam utilizados campos diferentes. Como regra geral, um primeiro fluxo de aquisição é realizado em um campo de controle na ausência de estimulação bacteriana para garantir a ausência de respostas espontâneas. Se forem observadas respostas espontâneas, as amostras são lavadas com tampão EM até que nenhuma resposta seja observada.
4. Para adicionar bactérias à amostra, remova 500 μL de tampão EM da câmara e adicione 500 μL da suspensão bacteriana preparada na etapa 1.1.6 para obter um OD_{final de 600 nm} de 0,05, com o devido cuidado para evitar mover o campo de microscopia selecionado; os volumes garantem uma mistura adequada das bactérias e uma distribuição homogênea das bactérias nas amostras de células.
5. Realize uma aquisição após a adição bacteriana. Alternativamente, realize uma aquisição 10 min após a adição bacteriana, que corresponde ao tempo necessário para as bactérias sedimentarem nas células nas condições utilizadas. No final do fluxo de aquisição, adquira uma imagem de contraste de fase do campo selecionado para visualizar as bactérias em contato com as células e os babados da membrana associados aos locais de invasão bacteriana.
6. Repita o procedimento de aquisição como na etapa 2.5, em intervalos que sejam adequados à duração das aquisições de imagens, salvamento de arquivos e seleção de um novo campo para cobrir todo o processo.
   Nota: Para Shigella, descobrimos que a aquisição flui a cada 5 min por 20 min, após a sedimentação bacteriana de 10 min, permitiu cobrir a maioria dos eventos de invasão.
7. No final do procedimento de aquisição, adicionar uma concentração final de 2 μM das amostras de ionóforo ionóforo de Ca²⁺ para determinar a amplitude máxima dos sinais de Ca²⁺. Adquira imagens a cada 3 - 5 s até a estabilização do sinal, geralmente por menos de 10 min.
8. Em seguida, adicione Ca²⁺ quelante etilenoglicol-bis(éter β-aminoetílico)-N, N, N', N'-ácido tetracético (EGTA) a uma concentração final de 10 mM para determinar o sinal de fluorescência na ausência de Ca²⁺. Adquira imagens a cada 3 - 5 s até a estabilização do sinal, geralmente por menos de 10 min.
   nota: Devido à dinâmica relativamente lenta das variações globais de Ca²⁺, realize essas aquisições a cada 3 a 5 s (não no modo de streaming), permitindo imagens de Ca²⁺ no mesmo campo microscópico durante os tratamentos sucessivos.

3. Análise

1. Expresse as variações citosólicas de Ca²⁺ ao longo do tempo como a porcentagem de ΔF/F0, onde ΔF representa a variação da intensidade média de fluorescência da região de interesse (ROI) e F0 a fluorescência basal na mesma ROI, à qual uma região não relevante do campo desprovida de células é subtraída.
   1. Remover os níveis de fluorescência basal para cada célula em diferentes campos, correspondentes aos níveis basais; esses níveis podem ser determinados de forma inequívoca devido à baixa frequência e duração relativamente curta das respostas locais de Ca²⁺ em uma determinada aquisição de fluxo.
      Nota: Quantifique as características marcantes das respostas relacionadas às perguntas feitas e ao modelo patogênico estudado. Classicamente, vários parâmetros são levados em consideração para analisar os sinais de Ca²⁺, incluindo a frequência das células que mostram respostas locais ou globais de Ca²⁺, bem como a duração, amplitude e frequência dessas respostas. No caso da Shigella e das respostas locais, outro aspecto importante da análise é a associação espacial das respostas com os locais de invasão bacteriana.
2. Para quantificar a porcentagem de células responsivas que apresentam respostas globais ou locais, desenhe ROIs nas células, em séries temporais correspondentes às variações da intensidade do Fluo-4.
   1. Defina parâmetros rigorosos para identificar respostas locais de Ca²⁺, como uma amplitude de três vezes acima das variações de fundo da linha de base média da intensidade de fluorescência da célula, ou uma duração de pelo menos 200 ms, para evitar a pontuação de um falso positivo.
      nota: Como regra geral, mesmo pequenas respostas locais de Ca²⁺ podem ser distinguidas de qualquer ruído de fundo por seu perfil. As ROIs devem ser grandes o suficiente para integrar sinais de fluorescência suficientes para permitir a detecção de variações locais. Dependendo da intensidade da detecção do Fluo-4, essas ROIs podem corresponder a círculos com diâmetros que variam de 2 a 5 mM.
   2. Meça as variações da intensidade média de fluorescência do Fluo-4 em 2 regiões em uma área distinta da mesma célula, para determinar se as respostas são locais ou globais.
      nota: A análise de um grande número de células é facilitada pelo uso de software de imagem que permite a exibição on-line das variações da intensidade média de fluorescência ao longo do tempo para as regiões selecionadas. O software de imagem disponível comercialmente tem essa opção, mas isso também pode ser feito usando o freeware Icy, usando o plug-in ROI Intensity Evolution.
   3. Determine a porcentagem de células que apresentam respostas locais.
      nota: Esse percentual é calculado a partir do número total de células analisadas no campo de microscopia, que deve ser em número suficiente para suportar uma significância estatística usando um teste não paramétrico.
   4. Determine a duração das respostas locais.
      nota: As respostas locais de Ca²⁺ podem ser distinguidas de acordo com seus intervalos de duração (ou seja, menos de 500 ms, entre 5 e 10 s ou acima de 10 s) e sua associação com locais de invasão de Shigella.
3. Quantifique a amplitude das respostas. Primeiro, calibre o Ca²⁺ máximo e os níveis de fundo celular determinados na etapa 2.1.7. Como a carga de Fluo-4 pode variar para cada célula, execute essas determinações para células individuais no campo.
   1. Expresse a amplitude das respostas como uma porcentagem relativa da resposta máxima.
   2. Realize testes estatísticos usando um teste de normalidade, seguido de um teste paramétrico para analisar possíveis diferenças na amplitude das respostas entre as amostras.
   3. Determine a associação dessas respostas em relação aos locais de invasão bacteriana por sua respectiva localização aos babados de membrana induzidos por bactérias visualizados nas imagens de contraste de fase correspondentes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph versão 7.7	Imagem Universal
Sistema de iluminação CoolLED pE-2	Roper Científico
Micro-prato 35 mm, altura	IBIDI	Rolamento 81156
Caldo de Tripticase de Soja (TCS)	Thermofisher	B11768
Ágar TCS	Thermofisher	B11043
Vermelho Congo	Sigma-Aldrich	Rolamento 75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017		Shigella flexneri sorotipo V. expressando a adesina AfaE
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017		Cepa mutante ipgD isogênica expressando a adesina AfaE