Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação de Pan-leucócitos
- Retire 1 mL de sangue periférico de um doador saudável (ou paciente) em uma seringa heparinizada. Certifique-se de ter a aprovação do comitê de ética responsável pela doação de sangue.
- Misture 1 mL de sangue periférico humano com 30 mL de tampão de lise ACK (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3 e 0,1 mM EDTA, pH 7,0) em um tubo de 50 mL e incube por 8 min em temperatura ambiente.
- Encha os tubos com PBS e centrifugue a 300 x g por 6 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 30 mL de tampão de lise ACK.
- Repita as etapas 1.2 e 1.3 até que o sobrenadante esteja claro. Finalmente, lave as células em PBS, centrifugue a 300 x g por 6 min em temperatura ambiente e ressuspenda o pellet celular em 2 mL de meio de cultura (RPMI1640 + 10% FCS). Incubar as células a 37 °C durante 60 min.
2. Carregamento de células Raji com SEB
- Prepare dois tubos Falcon de 15 mL com 1,5 x 106 células Raji por tubo. Gire as células (300 x g por 6 min em temperatura ambiente) e descarte o sobrenadante.
- Ressuspenda as células em meio residual (cerca de 50–100 μL), adicione 1,9 μL (1,9 μG) de SEB e incube em temperatura ambiente por 15 min. Adicione 5 mL de meio de cultura, gire as células (300 x g por 6 min à temperatura ambiente) e ressuspenda o pellet em meio de cultura (RPMI1640 + 10% FCS) a uma densidade de 1 x 106 células / mL.
3. Indução de Sinapses Imunes e Protocolo de Coloração
- Pipetar 500 μL da preparação de células Raji carregadas com SEB em um tubo FACS e 500 μL da preparação de células Raji descarregadas em outro tubo FACS. Adicione 650 μL de pan-leucócitos a cada tubo e gire as células (300 x g por 10 min à temperatura ambiente). Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 150 μL de meio de cultura (RPMI1640 + 10% FCS). Incubar a 37 °C (normalmente por 45 min).
- Agite suavemente as células (10 s a 1.000 rpm) e adicione 1,5 mL de paraformaldeído (1,5%) durante o vórtice para fixar as células. Interrompa a fixação adicionando 1 mL de PBS + 1% de BSA. Pellet as células (300 x g por 10 min em temperatura ambiente e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de PBS + 1% BSA após incubação em temperatura ambiente por 10 min.
- Pellet (300 x g por 10 min à temperatura ambiente) e ressuspenda as células em 100 μL de PBS + 1% BSA + 0,1% de saponina por 15 min em temperatura ambiente para permeabilizar as células (placa de 96 poços, em forma de U).
- Lave as células em PBS + 1% BSA + 0,1% de saponina com centrifugação (300 x g por 10 min à temperatura ambiente) e ressuspenda o pellet celular em 50 μL de PBS + 1% BSA + 0,1% de saponina contendo anticorpos ou compostos marcados com fluoróforo (CD3-PE-TxRed (1:30), Faloidina-AF647 (1:150) e DAPI (1:3.000)).
- Incube as células em temperatura ambiente no escuro por 30 min. Lave as células 3 vezes adicionando 1 mL de PBS + 1% BSA + 0,1% de saponina. Centrifugue a 300 x g por 10 min em temperatura ambiente. Ressuspenda novamente as células em 60 μL de PBS para citometria de fluxo de imagem.
4. Aquisição de imagem usando um citômetro de fluxo
NOTA: O procedimento de aquisição de imagem e análise de dados a seguir são baseados em citometria de fluxo de imagem usando software como imagestream (IS100), INSPIRE e IDEAS. No entanto, outros citômetros de fluxo e software de análise também podem ser usados.
- Abra o software de análise no computador conectado ao citômetro de fluxo de imagem e clique em Inicializar fluídica no menu Instrumento. Aplique as contas na porta direita quando solicitado.
- Carregue o modelo padrão no menu Arquivo e clique em Executar/Configurar. Escolha Contas no menu suspenso Exibir.
- Ajuste o iluminador de campo claro clicando em Definir intensidade se o valor indicado estiver abaixo de 200.
- Execute a rotina de calibração e teste na guia Assist clicando em Iniciar tudo.
- Clique em Flush/Lock/Load e aplique as amostras na porta esquerda quando solicitado. Depois de carregar as células no citômetro de fluxo, abra o classificador de células e ajuste os valores da seguinte forma: limite superior de intensidade de pico em 1,022 para cada canal, limite inferior de intensidade de pico em 50 para o canal 2 (DAPI) e canal 5 (CD3-Pe-TxR), limite inferior da área em 50 para o canal 1 (dispersão lateral) e limite superior em 1,500.
- Altere a potência do laser de excitação para 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) e 647 nm (90 mW) na guia Configuração.
- Alterne o menu suspenso Exibir entre Células e Grânulos para avaliar o classificador de células e os ajustes de potência do laser.
nota: Certifique-se de que todas as células e pares de células sejam encontrados na Visualização de células e que aglomerados, detritos e imagens de células com pixels saturados sejam encontrados na Visualização de detritos alterando os classificadores de células e/ou as potências do laser de excitação.
- Defina o nome da amostra e o número de imagens a serem adquiridas (15.000 a 25.000 para amostras e 500 para controles de compensação) na guia Configuração. Clique em Executar/Configurar para iniciar a aquisição.
