Um ensaio para estudar a regulação da fagocitose de macrófagos por células-tronco mesenquimais

Resumo

Fonte: Evans, J. F., et al. Regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose de macrófagos; Quantificação e Imagem. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra um ensaio para estudar a regulação de células-tronco mesenquimais (MSC) da fagocitose de macrófagos em uma cocultura. Após a co-cultura de MSC com macrófagos, partículas de zimosana não opsonizadas conjugadas a um fluoróforo sensível ao pH são adicionadas para serem fagocitadas pelos macrófagos. Com o aumento da fagocitose, a intensidade da fluorescência aumenta, permitindo a determinação da regulação da atividade fagocítica mediada por CTM.

Protocolo

NOTA: Todas as técnicas de preparação de meios e cultura celular são realizadas em condições assépticas usando uma cabine de biossegurança com fluxo laminar. Todas as etapas de incubação da cultura descritas são realizadas usando uma incubadora projetada para manter uma atmosfera de 37 °C, 5% de CO₂ e 95% de umidade.

1. Cultura de células

1. Preparação do meio de crescimento
   1. Para MSC (células-tronco mesenquimais) e LADMAC (macrófagos derivados da medula óssea de camundongo; é derivado dos nomes dos pesquisadores que estabeleceram a linha celular: Laskin, Dower e Malech), adicione 50 mL de FBS e 5 mL de mistura antibiótica/antimicótica 100x a 500 mL de DMEM com alto teor de glicose (meio Eagle modificado de Dulbecco).
   2. Para os macrófagos (MΦ), adicionar 50 mL de FBS, 100 mL de meio de condição LADMAC (preparado seguindo os passos da seção 1.2) e 5 mL de mistura antibiótica 100x a 500 mL de DMEM de alta glicose.
      nota: As células LADMAC produzem fator estimulador de colônias (CSF-1) necessário para apoiar o crescimento das células MΦ.
2. Propagar células em preparação para co-cultura
   1. Para semear células MSC e MΦ do estoque congelado, equilibre 9 mL de meio de crescimento apropriado preparado na seção 1.1 em cada uma das quatro placas tratadas com culturas de células de 100 mm para cada tipo de célula e coloque na incubadora de cultura de células por 15 min.
   2. Enquanto isso, descongele rapidamente as alíquotas de 10⁶ células congeladas, incubando-as em banho-maria a 37 °C por 2-3 min ou até descongelar. Em seguida, adicione as células MSC descongeladas a 9 mL de meio de crescimento MSC fresco e adicione as células MΦ descongeladas a 9 mL de meio de crescimento MΦ fresco em tubos cônicos estéreis de 15 ou 50 mL e centrifugue a 125 x g em um rotor de balde oscilante por 5 min.
   3. Aspirar ou decantar o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 4 ml do meio de crescimento fresco adequado, pipetando suavemente para cima e para baixo. Adicionar 1 ml da suspensão celular a cada uma das quatro placas de 100 mm para cada tipo de célula que foram equilibradas no passo 1.2.1.
   4. Devolva os pratos com células para a incubadora. Troque o meio a cada 2-3 dias até 70%-80% confluente.

2. Semear MSC em pratos experimentais, Dia 1

NOTA: Antes de semear o MSC, projete o layout experimental da placa de 96 poços para espectrofotometria fluorescente e a lâmina da câmara para imagens dinâmicas. Para a placa de 96 poços, flanqueie os poços experimentais com poços contendo células, mas não os use no ensaio. Marque pelo menos quatro alvéolos a serem usados para o branco do reagente (RBL). Consulte a Tabela 1 para obter um exemplo de modelo de 96 poços e a Tabela 2 para obter um exemplo de um modelo de lâmina de câmara de 4 poços. Recomenda-se o uso de placas pretas ou brancas de 96 poços com fundo transparente. Uma lâmina de câmara de vidro borossilicato de 1,5 mm é ideal, mas o número de câmaras pode ser ajustado dependendo do desenho do estudo. Um fluxograma resumido dos métodos a seguir está incluído na Figura 1.

1. Na confluência de 70% a 80%, aspirar o meio de crescimento das culturas em placas de 100 mm e adicionar 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para isolar o MSC.
2. Aspire o PBS, adicione 2 mL de tripsina a 0,05% / EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) e coloque-o na incubadora de cultura por 3-5 min.
3. Após 3 min, verifique o descolamento da célula usando um microscópio invertido. Se as células estiverem separadas, continue para a próxima etapa; Caso contrário, continue a incubação por mais 1-2 min. Não incube por mais de 5-6 min.
4. Adicione 5 mL de meio de crescimento fresco ao prato com as células destacadas. Enxágue o prato usando a mistura de tripsina / meio e colete as células em um tubo cônico limpo e estéril de 50 mL usando uma pipeta sorológica estéril.
5. Centrifugue por 5 min a 125 x g. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mL de meio de crescimento fresco, pipetando suavemente para cima e para baixo.
6. Para contar as células, adicione 10 μL da suspensão celular a 30 μL de solução de azul de tripano a 0,4% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Em seguida, pipetar 10 μL da mistura sob a lamínula de uma câmara de contagem de hemocitômetros.
7. Usando um microscópio de campo invertido ou claro, com a objetiva de 10x, conte as células não coradas (viáveis) em quatro dos quadrados de 1 mm². Calcular o número de células utilizando a fórmula: células/ml = contagem de células/# 1 mm² quadrados x factor de diluição x 10⁴,
   nota: Para este exemplo, o número de quadrados de 1 mm² contados é quatro e o fator de diluição é 4.
8. Use a equação C₁V₁ = C₂V₂ para calcular e preparar uma suspensão de 1 x 10⁵ células/mL. Prepare 1 mL de suspensão de célula/mL para cada coluna da placa de 96 poços a ser preenchida e 0,75 mL para cada câmara da lâmina da câmara de 4 poços a ser preenchida de acordo com o projeto da placa.
   nota: C₁ = contagem de células, V₁ = o que está sendo calculado, C₂ = 1 x 10⁵, V₂ = 5,50 mL.
9. Determine V₁ e subtraia-o dos 5,50 mL desejados do volume total para determinar o volume do meio fresco necessário para preparar a suspensão. Adicione o volume de células (V₁) da suspensão original ao volume de meio fresco para um total de 5,50 mL com 1 x 10⁵ células / mL.
10. Adicione 100 μL de suspensão de 1 x 10 5 células/mL a cada poço da placa de 96 poços de acordo com o projeto da placa usando um micropipetador multicanal e 530 μL a cada um dos poços da lâmina da câmara usando uma micropipeta de acordo com o projeto da placa. Incubar durante a noite.
    nota: Para este experimento, as MSCs são revestidas nas colunas 1, 2, 3 e 6 da placa de 96 poços (Tabela 1) e nos poços 1 e 2 da lâmina da câmara de 4 poços (Tabela 2). Portanto, pelo menos 5,50 mL de uma suspensão de 1 x 10⁵ células/mL são preparados. MΦ a 80% de confluência é tratada com mediadores inflamatórios no mesmo dia em que as MSCs são semeadas nas placas experimentais.

3. Isolar o MΦ e preparar as co-culturas, Dia 2

1. Remova o meio de ativação das células MΦ e substitua-o por 5 mL de meio de crescimento fresco. Raspe suavemente com um elevador de células e colete as células em um tubo cônico de 50 mL.
2. Conte as células usando exclusão de azul de tripano e hemocitometria conforme descrito para MSC nas etapas 2.6-2.7.
3. Usando a equação nas etapas 2.8-2.9, prepare duas suspensões separadas de 2 x 10⁵ células/mL, uma com células do controle e outra com células das culturas MΦ tratadas.
   nota: Prepare 1 mL de suspensão de célula/mL para cada coluna da placa de 96 poços a ser preenchida e 0,75 mL para cada câmara da lâmina da câmara de 4 poços a ser preenchida de acordo com o projeto da placa.
4. Aspire suavemente o meio dos poços experimentais da placa de 96 poços contendo MSC. Usando uma micropipeta multicanal, adicione 100 μL das suspensões de células MΦ tratadas e de controle nos poços experimentais apropriados com e sem MSC de acordo com o projeto da placa. Incubar durante a noite.
5. Aspire suavemente o meio da lâmina da câmara de 4 poços contendo MSC e, usando uma micropipeta, adicione 530 μL de suspensão de células MΦ aos poços apropriados de acordo com o projeto. Incubar durante a noite.

4. Ensaio de fagocitose, leitura cinética fluorescente de 96 poços, Dia 3

1. Defina os parâmetros do ensaio
   1. No dia do ensaio, ligue o leitor de placas fluorescentes e ajuste a temperatura do sistema para 37 °C.
   2. Abra o software System Pro e verifique o ícone do instrumento no canto superior esquerdo para determinar se o instrumento está conectado ao computador. Se o círculo vermelho com uma linha estiver visível, clique no ícone do instrumento e escolha o instrumento na janela pop-up para fazer a conexão.
   3. Selecione Novo experimento para acessar a janela pop-up do Auxiliar de configuração de placa. No menu Auxiliar de configuração de placa, selecione Definir suas configurações de aquisição.
   4. Selecione Monocromador no menu de configurações para a configuração óptica. Selecione FL (fluorescência) para o modo de leitura e Cinética para o tipo de leitura.
   5. Na mesma janela de configurações, em Categoria, clique em Comprimentos de onda e defina as larguras de banda para 9 nm para excitação e 15 nm para emissão.
   6. Defina o número de pares de comprimentos de onda como 1. Regular os comprimentos de onda LM1 para 510 nm para excitação e 540 nm para emissão.
   7. Continue pelas categorias e selecione Tipo de placa a seguir. Selecione a opção que corresponde ao tipo de placa que está sendo usada.
      nota: É importante que a seleção corresponda ao tipo de placa. As alturas de leitura são definidas pelo sistema de acordo com a seleção.
   8. Em seguida, selecione Área de Leitura e destaque a área da placa de 96 poços incluída no projeto experimental.
   9. Selecione PMT e Óptica, defina PMT Gain como Alto e Flashes por leitura como 6. Marque a caixa ao lado de Ler de baixo para baixo se estiver usando uma placa de fundo transparente.
   10. Selecione Tempo e defina para intervalos de 10 minutos em um período de 70 minutos.
   11. Selecione Agitar, marque a caixa Antes da primeira leitura e defina-a para 5 segundos. Marque a caixa Entre leituras e defina-a por 3 segundos. Defina a intensidade da agitação para baixo e linear.
   12. Feche a janela. Quando a janela Auxiliar de configuração de placa for exibida, selecione Configurar o layout da placa. Destaque os poços BL do design da placa e clique em Placa em branco.
   13. Realce cada uma das linhas experimentais, clique em Adicionar, nomeie o grupo e selecione uma cor.
   14. Em Opções de atribuição abaixo do design da placa, selecione Série e, em seguida, defina a série na janela e clique em OK. Repita para cada grupo.
2. Prepare a suspensão de zymosan
   1. Enquanto espera que a temperatura do sistema atinja 37 °C, ressuspenda 1 mg de partículas de zigosano em 5 mL do meio de imagem de células vivas.
      1. Adicione 1 mL de meio de imagem de células vivas ao frasco que contém as partículas e colete-as em um tubo de cultura de vidro. Enxágue o frasco com mais 1 mL de solução de imagem e transfira-o para o mesmo tubo de vidro para garantir que todas as partículas sejam transferidas. Adicione 3 mL de solução de imagem adicional para obter 0,2 mg/mL de suspensão de partículas.
   2. Vórtice com pulsos rápidos por 30-60 s. Em seguida, use um sonicador de sonda para sonicar com 60 pulsos rápidos.
      nota: É muito importante criar uma suspensão homogênea de partículas e não deixar a suspensão descansar por muito tempo antes de adicionar aos poços experimentais. A aglomeração se repete rapidamente. A densidade de partículas por célula pode precisar ser otimizada dependendo da fonte, tratamento e densidade de MΦ usada. Nos estudos apresentados, foram utilizadas partículas conjugadas de zimosana. No entanto, E. coli conjugada e S. aureus também estão disponíveis.
3. Adicione zymosan e leia a placa
   1. Aspire o meio dos poços experimentais e enxágue 1x com 100 μL da solução de imagem de células vivas. Enxágue também os poços RBL com a solução de imagem de células vivas.
   2. Aspirar a solução de imagem de células vivas dos poços experimentais e RBL e substituí-la por 100 μL da suspensão de partículas zigosanas.
   3. Abra a bandeja de placas do leitor fluorescente usando a interface do touchpad. Coloque o prato, sem a tampa, na bandeja com o poço A1 no canto superior esquerdo. Feche a bandeja usando o touchpad e clique no botão verde Ler no menu superior.
   4. Quando a leitura estiver concluída, salve o arquivo na pasta apropriada e exporte os dados em formato de planilha clicando em Arquivo e selecionando Exportar.
   5. Calcule a fluorescência relativa média ± SEM para cada grupo replicado em cada ponto de tempo (10 min, 20 min, 30 min, etc.) na planilha (Arquivo Suplementar 1) e transfira os dados para o software gráfico.
   6. Use um formato de gráfico de linhas para apresentar os dados e aplique ANOVA de duas vias (Tempo x Tratamento/MSC como fatores) seguido do teste de comparações múltiplas de Tukey para determinar diferenças entre grupos individuais.
      nota: Enquanto a leitura da placa de 96 poços estiver em andamento, prepare a placa de imagem dinâmica para aquisição de imagem com lapso de tempo. Certifique-se de que a imagem dinâmica prossiga com a análise de um poço experimental de cada vez.

Tabela 1: Exemplo de um projeto de placa de 96 poços. CBL - Célula em branco; MSC - semeado dia 1; MΦ+ tratado e MΦ não tratado no dia 2; Branco do reagente RBL adicionado no dia 3 do ensaio.

	1	algarismo	3	4	5	6	7
um	CBL	MSC / MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
O	CBL	MSC / MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
O	CBL	MSC / MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
D	CBL	MSC / MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
E	CBL	MSC / MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
O	CBL	MSC / MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
O	CBL	MSC / MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
H	CBL	MSC / MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL

Tabela 2: Exemplo de um projeto de lâmina de câmara de 4 poços. MSC - banhado dia 1; MΦ+ tratado e MΦ não tratado no dia 2.

1	algarismo	3	4
MSC / MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+

Resultados

Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho do ensaio de co-cultura e fagocitose. Um esboço do fluxo de trabalho para análise quantitativa e qualitativa da atividade de fagocitose MΦ em co-cultura com MSC.

Arquivo Suplementar 1: Um arquivo de planilha representativo de dados cinéticos brutos de um experimento ótimo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microplaca de poliestireno preto de 96 poços	MilliporeSigma	CLS3603-48EA
Solução de azul de tripano a 0,4%	MilliporeSigma	T8154-20ML
Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno estéril de 15 mL e 50 mL	ThermoFisher	339653
Antibiótico-Antimicótico (100X) Gibco	ThermoFisher	15240096
Elevador de células	MilliporeSigma	CLS3008-100EA
Balões de cultura tratados para cultura de tecidos, superfície de 75 cm2, gargalo inclinado, com tampa, filtrado	MilliporeSigma	C7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]	ATCC	CRL-12424	Linha celular MSC de camundongo
DMEM, glicose alta	ThermoFisher	11965092
Soro fetal bovino, qualificado, inativado por calor	ThermoFisher	16140071
Hemocitômetro	FisherScientific	02-671-51B
I-11.15	ATCC	CRL-2470	Linha celular MΦ de camundongo
Linha celular LADMAC	ATCC	CRL-2420	As células LADMAC secretam o fator estimulador de colônias do fator de crescimento 1 (CSF-1).
Solução de imagem de células vivas	ThermoFisher	A14291DJ
PBS, pH 7,4	ThermoFisher	10010031
Conjugado de biopartículas de Zymosan verde de pH Rhodo	ThermoFisher	Pág. 35365
Espectros i3X	Dispositivos Moleculares
Unidades de filtro a vácuo estéreis de uso único, 250 mL, 0,2 μm	ThermoFisher	Rolamento 568-0020
Filtros de seringa estéreis, 0,2 micrômetro	ThermoFisher	Rolamento 723-2520
Placas de cultura tratadas com cultura de tecidos, 100 mm x 20 mm	MilliporeSigma	CLS430167-100EA
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	ThermoFisher	25300054